EvaGreen ® & EvaGreen ® Plus : 下一代 qPCR 染料

EvaGreen® 染料是下一代 DNA 结合染料，是定量实时 PCR (qPCR) 和许多其他应用的理想选择。Biotium 科学家在设计染料时考虑了与 PCR 相关的几种基本染料特性，包括染料的 PCR 抑制、安全性、稳定性和荧光光谱。我们努力的结果是一种优于 SYBR® Green I 和其他商用 PCR 或高分辨率熔解曲线 (HRM) 染料的染料。 *

EvaGreen® 染料用于 Biotium 的所有基于染料的 qPCR 预混液，它结合了卓越的亮度和灵敏度，并能够在同一反应中进行灵敏的熔解曲线分析。此外，EvaGreen® 染料无毒、无致突变性，对水生生物无害。

EvaGreen® Plus Dye 是 Biotium 原始 EvaGreen® 染料的改进替代品，它保留了相同的基本优势，同时提供更高的信噪比。EvaGreen® Plus 的较低背景和较高信号为数字 PCR 和等温应用提供了更多优势。

图 1. EvaGreen® 染料通过一种新颖的“按需释放”机制与 dsDNA 结合。

图 2. EvaGreen® 无毒、无致突变性且对水生生物无害。

DNA结合的机制

EvaGreen® DNA 结合染料是通过“按需释放”机制使用 DNA 结合的新概念设计的（图 1）。该染料由两个单体 DNA 结合染料构成，通过柔性间隔物连接。在没有 DNA 的情况下，二聚体染料呈现环状构象，在 DNA 结合中没有活性。当 DNA 可用时，环状构象通过平衡转变为能够与 DNA 结合以发射荧光的随机构象。

随着在 PCR 过程中形成更多的 DNA，这种化学平衡提供了一种独特的机制，可以从“储备”（即呈环状构象的染料）中持续提供染料的活性形式。因此，可以配制具有相对高染料浓度的 EvaGreen® 预混液，以在没有 PCR 抑制的情况下最大化荧光信号，使该混液适用于 qPCR 和 HRM 应用。 *

特征

• 环境安全
  无诱变性、无细胞毒性，对水生生物安全，可安全处理并易于排放到下水道中。

• 优于 qPCR 和等温扩增
  由于其新颖的“按需释放”DNA 结合机制，在检测扩增方面比 SYBR® Green I 亮得多。

• 无与伦比的 DNA 熔解曲线性能
  低 PCR 抑制允许使用饱和染料浓度进行最大信号和高分辨率 DNA 熔解分析。

• 极其稳定
  在储存期间或在 PCR 条件下稳定。

• 既可用作 qPCR 染料又可用作 DNA 凝胶染色剂
  PCR 反应后，可使用紫外透照仪或蓝灯箱直接在凝胶上观察 PCR 产物，无需另一种凝胶染色剂。

• 与多重 PCR 兼容
  扩增子之间缺乏染料迁移，可以通过熔解曲线检测多种 PCR 产物。

• 对其他应用有用
  目前唯一可用于液滴数字 PCR (ddPCR) 的 qPCR 染料。EvaGreen® 还可用于等温扩增、微流控 PCR 系统、毛细管凝胶电泳等。

卓越的 PCR 性能

PCR 染料通过形成染料-DNA 复合物来发射荧光。与 DNA 的相互作用不可避免地会导致一些 PCR 干扰。染料对 PCR 的抑制在 PCR 的早期阶段尤其严重，此时染料与 DNA 的比率很高。另一方面，足够的染料浓度对于产生良好的信号很重要。因此，必须使用最佳染料浓度以获得可靠的 PCR 性能。

对于许多当前的 DNA 结合 PCR 染料，例如 SYBR® Green I，最佳染料浓度可能非常低，这限制了 PCR 信号，也使染料不适用于高分辨率熔解曲线 (HRM) 分析。此外，由于染料从小扩增子迁移到大扩增子，具有低 SYBR® Green 浓度的预混液可能无法通过解链峰检测多个扩增子，从而为 PCR 提供干净的单个扩增子的错误结果，实际上可能会产生几个产品。

图 3. 使用两种 EvaGreen® 预混液（Forget-Me-Not™ EvaGreen® 和 Fast EvaGreen®）和 QuantiNova SYBR® Green 进行的 qPCR 反应的原始荧光信号比较。EvaGreen® Dye 比 SYBR® green 抑制性更小，信号更亮。

微滴式数字 PCR 的行业标准

EvaGreen ® 是唯一经过验证可用于液滴数字 PCR (ddPCR) 的 DNA 结合染料

重点引用： EvaGreen® 染料所展示的卓越性能使其成为第一个也是唯一一个适用于 ddPCR 应用的 DNA 结合染料。ddPCR 技术最初设计用于基于荧光探针的检测，通过将样品分成数千个可以单独测量的液滴，实现了定量多重 PCR。在分析化学的出版物中，McDermott 等人。演示如何将 EvaGreen® 染料与 ddPCR 结合使用，通过区分每个液滴的扩增 DNA 质量来分析样品中的多个目标。结果表明，基于 EvaGreen® 的 ddPCR 的性能与基于 TaqMan® 的 ddPCR 相当，并且没有增加荧光探针的复杂性和成本。EvaGreen® 染料目前已获准用于 Bio-Rad 的 QX200 ddPCR™ EvaGreen® Supermix 和其他 ddPCR 相关试剂。

EvaGreen® 染料安全

EvaGreen® 染料相对于其他 PCR 和 HRM 染料的另一个主要优势是它的安全性。EvaGreen® 染料是迄今为止第一种也是唯一一种对环境安全的 PCR 染料。

尽管 PCR 在研究和诊断中的使用越来越多，而且 DNA 结合染料由于可能引起突变而具有固有的危险性，但很少有人对其安全性进行彻底研究。

因此，处理和处置 PCR 预混液可能是一个健康和环境问题。事实上，SYBR® Green I 被发现比最知名的诱变剂之一溴化乙锭更具环境毒性。SYBR® Green I 被认为会干扰细胞中的 DNA 修复机制，因此它会增强化学品的遗传毒性以及紫外线对 DNA 的损伤。

尽管没有关于其他 PCR 和 HRM 染料（例如 SYTO9、LC Green、BRYT Green 和 ResoLight）的安全数据，但众所周知这些染料会在几分钟内进入细胞，因此具有潜在的遗传毒性风险。考虑到这一点，Biotium 的科学家设计了 EvaGreen® 染料，通过增加染料的分子大小和电荷使细胞膜不透水（图 4）。由于 EvaGreen® 染料无法与活细胞中的基因组 DNA 相互作用，因此它比其他染料安全得多。独立实验室测试证实，EvaGreen® 不致突变、无细胞毒性并且对水生生物安全。该染料已通过加利福尼亚州的环境危险废物法规（CCR 标题 22），易于排放到下水道中。有关详细信息，请参阅EvaGreen® 安全报告。

EvaGreen® 染料稳定性

EvaGreen® 染料在储存期间和 PCR 条件下都非常稳定。据报道，EvaGreen® 染料在高达 65°C 的温度下在实时 PCR 现场使用长达 6 个月时仍然稳定（Mil Med. 2014 179(6):626-32）。

另一方面，众所周知，SYBR® Green I 在多次冻融循环后和 PCR 条件下会降解。此外，据报道，分解的 SYBR® Green I 对 PCR 的抑制作用更强。因此，在评估基于 EvaGreen® 的预混液的性能时，您可以将染料的稳定性作为变量排除。

光谱兼容性

EvaGreen® 染料在光谱上与 FAM 或 SYBR® Green I 相似，这意味着使用基于 EvaGreen® 的预混液无需更改光学设置。

其他 EvaGreen® 染料应用

EvaGreen® 染料是目前唯一用于液滴数字 PCR (ddPCR) 的 qPCR 染料。

EvaGreen® 染料已应用于许多其他应用，例如 Fluidigm® 微流体 PCR 系统、等温扩增、毛细管凝胶电泳、溶液中的 DNA 定量以及细胞活力测试中死细胞的选择性检测。Biotium 提供 EvaGreen® 独立染料、EvaGreen® qPCR 预混液以及其他用于 qPCR 的试剂和试剂盒。

图 4. EvaGreen® 染料比 SYBR® Green I 更安全，因为它是细胞膜不可渗透的，因此无法接触活细胞核中的 DNA。

图 5. 使用 EvaGreen® 预混液 (Forget-Me-Not™ EvaGreen®) 或 SYBR® Green 预混液 (QuantiNova SYBR® Green) 对 GAPDH qPCR 产物进行的熔解曲线分析。EvaGreen® Dye 比 SYBR® Green 对 PCR 的抑制更小，允许您使用更多染料，从而获得更强的熔解曲线信号。

*执行 HRM 可能需要 Idaho Technology 的许可。