我们的大多数产品在室温下可稳定保存数日，因此产品很可能仍能正常工作。为了安全起见，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前，先进行小规模的阳性对照实验，以确认该产品仍然适用于您的应用。

我们知道的一个例外是 GelGreen™，它比我们大多数其他荧光染料对光照更敏感。如果 GelGreen™ 长时间（数天至数周）暴露在环境光下，其颜色将从深橙色变为砖红色。如果发生这种情况，GelGreen 将不再适用于凝胶染色。

据出版物报道，测定中血清浓度超过 10% 可能会影响结果。

有关详细信息，请参阅以下出版物

https://doi.org/10.2144/04373ST05

https://dx.doi.org/10.1007%2Fs10616-007-9057-4

不会。组织的固定、冷冻、切片或解离会影响外叶上的 PS 并损害膜的完整性。Annexin V 和 Ethidium Homodimer III 都依赖于健康细胞中完整膜的存在，以准确区分健康细胞与凋亡或坏死细胞。要检测固定细胞和组织中的细胞凋亡，我们推荐使用我们的 TUNEL 试剂盒。目前我们还不知道有专门检测固定组织坏死细胞的荧光探针。根据形态学标准识别组织切片中的坏死细胞。

是的，染色后可以用甲醛固定细胞。由于 Annexin V 染色依赖于钙，因此所有用于洗涤和固定的缓冲液都应含有 1.25 mM CaCl2。固定可能会增加 Ethidium Homodimer III 的背景信号。在固定前清洗细胞数次以去除未结合的 Ethidium Homodimer III。

在使用细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（目录号30027）染色后不建议固定，因为死细胞染料 EthD-III 会转移到所有细胞并且不会维持死细胞特异性染色。我们的 Live-or-Dye™ NucFix™ Red（目录号32010）是一种可用于细菌的甲醛固定死细胞染料。

Viability qPCR (vPCR) 可以作为定量活细菌和死细菌的替代策略。使用死细胞特异性染料 PMA（目录号40019）或 PMAxx（目录号40069）在光交联后共价修饰 DNA（仅死细胞），使用简单的定量 PCR (qPCR) 扩增选择性扩增活细胞DNA。

不，无论细胞数量如何，Annexin V 和 Ethidium Homodimer III 的浓度都应保持恒定。但是，如果需要优化染色，可以增加或减少染色浓度。

结合缓冲液是一种含钙的等渗缓冲液，钙是膜联蛋白 V 与磷脂酰丝氨酸结合所必需的。

The Annexin V protein that we use is a recombinant protein made in E. coli.

Annexin V is a 36 kDa protein that binds to the phospholipid phosphatidylserine. Therefore Annexin V binding is not species-specific.

Live -or-Dye™ 可固定活性染色剂，包括Live-or-Dye NucFix™ Red，是胺反应性的死细胞染色剂。染料的这种特性使染色与固定兼容，但在多细胞层系统（如 3D、Matrigel® 或类器官培养）中具有挑战性。由于染料具有反应性，因此大部分染色将仅限于外部/暴露的细胞层。更长的孵育时间让染料更深入地渗透到细胞层通常不会有帮助，因为标记反应是短暂的（15-30 分钟）。

请参阅我们对适用于3D 培养物或类器官的染料的建议。

对于可固定的核死细胞染色剂，可以考虑的其他选择是NucSpot® Far-Red。该染料旨在作为更常见的死细胞染料 7-AAD 的改进替代品，在一定程度上是可固定的。虽然通常更适合流式细胞术，因为它的光谱特性不适合标准荧光显微镜，但使用共聚焦成像可能更好，因为 Ex/Em 可以更适当地匹配。我们还建议在固定后立即成像，不要在固定后长时间储存样本，因为染色会随着时间的推移而恶化。

活力染料PMA可能是另一种可能。PMA 是碘化丙锭 (PI) 的光反应版本，通常用于细菌的活力 PCR。但是，它可用于哺乳动物细胞（根据内部客户反馈）作为流式细胞仪的可固定死细胞染色剂。PMA 在与 DNA 结合之前不会发出荧光。随后暴露在强光下会激活染料并使其与 DNA 原交联，使其可固定。染料与细胞的孵育需要在黑暗中进行，并且在暴露于光下进行光交联之前将多余的染料洗掉。可能需要优化曝光源（可以使用 LED 灯来避免热量）和光强度（亮度足以使染料交联而不会发生光漂白；通常需要靠近明亮的 LED 或卤素灯，室内光线不足） .

Live-or-Dye NucFix™ Red 是一种活性染料，大多数细胞培养基，即使它们不含血清，也含有高浓度的反应基团，这些基团会与染料发生反应，使其失去反应性。虽然染料仍会进入细胞内部，并且染色会特定于细胞核（染料是荧光性的，只有在与 DNA 结合时才会发出荧光），但它不会保持可固定性。

PMA 和 PMAxx ™ 是光反应性、细胞不可渗透的 DNA 结合染料，可能是培养基中细胞染色的可固定染料的更好选择。染料需要蓝光进行光活化。标准蓝色 LED 可用于染料与 DNA 的光交联。如果不需要持久固定，并且细胞不会进行广泛的透化处理，则NucSpot® Far-Red 或7-AAD等更易固定的死细胞染料  可能是合适的选择。尽管信噪比不如未固定细胞，但这些染料比其他死细胞染料（如碘化丙啶 (PI)）更易固定。

Biotium 的 TUNEL 检测试剂盒含有 TdT（小牛胸腺），一种在大肠杆菌中产生的重组蛋白。

您可能希望分别处理漂浮和分离的细胞——收集洗涤液并离心，然后使用悬浮细胞方案对这些细胞进行染色。或者，您可以收集漂浮细胞，用胰蛋白酶（不含 EDTA）分离贴壁细胞，将细胞混合在一起，然后使用悬浮细胞方案进行染色。

检查以确保您的细胞密度在细胞活力测定的线性范围内。太少的细胞可能会低于检测限，太多的细胞可能会使 OD 饱和。执行初始实验以检查您的细胞类型和实验设置的最佳线性范围。您可能需要改变细胞密度测定孵育时间。套件协议提供了一般指南，可能需要针对您的实验系统进行优化。

ViaFluor® SE染料容易水解。理想情况下，应在使用当天准备 DMSO 储备溶液，目的是提供的每个小瓶仅供一次性使用。如果需要较小的等分试样，最好在重构时将初始 DMSO 库存等分到一次性使用的数量，并在 -20°C 下避光和防潮（干燥）储存长达一个月。但是，随着时间的推移，活动可能会减少。染料只能在染色前立即添加到水性缓冲液中。水溶液不能储存以供重复使用。

我们的ViaFluor® SE 细胞增殖测定是一种用于细胞分裂的染料稀释测定，例如 Thermo 的 CFSE 和 CellTrace™ Violet。这种类型的测定通常用于测量培养和体内的淋巴细胞增殖反应（如果将标记的细胞注射回小鼠体内）。它需要流式细胞仪进行分析，并允许您计算标记细胞中发生了多少次细胞分裂。

有关将荧光 ViaFluor® SE 染料与 PMBC 结合使用的更多信息和典型程序，它可以很容易地适应其他细胞类型，请参阅我们的技术提示：通过流式细胞术测量 PMBC 中的细胞分裂

如果不能选择流式细胞仪，我们可以提供基于吸光度和荧光的微孔板检测来定量细胞数量。这些测量线粒体活性（刃天青/MTT/XTT）或细胞内酯酶活性（钙黄绿素 AM）作为活细胞数量的读数。请访问细胞活力和细胞凋亡技术页面了解更多信息。

ATP -Glo™ 测定是一种用于细胞 ATP 水平的发光测定，其与活细胞数量成正比。该测定需要光度计。

CellTrace 是 Thermo Fisher Scientific 的商标。

我们的刃天青细胞活力测定（货号 30025）具有红色荧光（Ex/Em 530-560/590 nm），专为酶标仪设计。它是一种经济、易于使用且均质（无需清洗）的活细胞定量分析方法。它类似于 alamarBlue®、PrestoBlue® 和 CellTiter-Blue®。

Calcein AM Cell Viability Assay（货号 30026）具有绿色荧光（Ex/Em 485/530 nm），也适用于酶标仪。该测定需要在缓冲液中添加活性染料之前从细胞中去除培养基。我们还提供动物活细胞和死细胞的活力/细胞毒性测定，它结合了钙黄绿素-AM 和荧光死细胞染色剂 EthD-III，并且与酶标仪兼容。

alamarBlue 是 Trek Biosystems 的注册商标。CellTiter-Blue 是 Promega 公司的注册商标。PrestoBlue 是 Thermo Fisher Scientific 的注册商标。

MTT 和 XTT 是基于比色的测定，而刃天青可以使用比色或荧光检测来测量。MTT 不是可溶性产品，因此在测量吸光度之前必须先裂解细胞以溶解甲臜盐。XTT 和刃天青不需要细胞裂解，允许在不同时间点对相同样品进行动力学监测。

AlamarBlue® 包含刃天青和其他化合物，以防止刃天青过度还原为非荧光产品。这些添加剂还减慢了荧光产物的产生速度。因此，与刃天青相比，alamarBlue® 测定需要更长的孵育时间。

刃天青被细胞还原为荧光产物试卤灵。试卤灵可以进一步还原为非荧光化合物。因此，由于底物的过度还原，最密集的孔可能具有最低的荧光。套件协议提供了一般指南，可能需要根据经验针对您的实验系统进行优化。您可能需要改变细胞密度或测定孵育时间，以确保您的样品落在试剂盒的线性范围内。

含有酚红的培养基与刃天青测定相容。酚红不干扰刃天青反应，也不影响检测。

CellBrite® 细胞质膜染色剂是亲脂性染料，用于对活细胞或固定细胞的细胞膜进行简单、无毒、稳定的标记。可以在 CellBrite® 染色之前或之后用甲醛固定细胞。但该染色对透化或甲醇固定的耐受性较差，因此 CellBrite® 染色不易与细胞内免疫荧光 (IF) 染色相结合。染料也不会沾染细菌或酵母。CellBrite® NIR染料是具有近红外荧光的 CellBrite® 染料，与小动物 NIR 成像系统兼容。

CellBrite® Fix和 MemBrite® Fix 染色剂的开发就是为了克服其中的一些缺点。它们是新型共价染料，可以固定和透化用于 IF 染色。CellBrite® Fix Membrane Stains 是荧光反应性膜染料，可在质膜上快速积累。当它们掺入脂质中时，它们会发出荧光，同时与膜蛋白发生共价反应以实现稳定标记。一步染色仅需 15 分钟，无需清洗。CellBrite® Fix 可对哺乳动物细胞、酵母和细菌进行染色。

MemBrite® Fix Cell Surface Stains不结合脂质，但标记细胞表面蛋白。MemBrite® Fix 需要一个带洗涤的两步染色方案，但提供比 CellBrite® Fix 更广泛的染料颜色选择。MemBrite® Fix 也可用于酵母染色。但与原始的 CellBrite® 染料和凝集素不同，CellBrite® Fix 和 MemBrite® Fix 不能用于已经固定的细胞。

要选择适合您应用的染料，请参阅我们的膜和细胞表面染色比较

CellBrite® 细胞质膜染料不能有效地染色 EV，但 CellBrite® Fix、MemBrite® Fix、CellBrite® Steady 和其他染色剂已用于此应用。但是，为了对外泌体膜进行最佳染色，我们推荐使用我们的ExoBrite™ EV 膜染色剂。

Biotium 的 CellBrite® 细胞质膜染料是染料输送溶液，可以直接添加到普通培养基中，以均匀标记培养物中的悬浮或贴壁细胞。PKH 染料是用于细胞膜标记的结构相关染料。但与 CellBrite® 不同的是，使用 PKH 染料进行标记需要多个步骤并将细胞置于等渗甘露醇加载介质中，这会对细胞膜的完整性和活力产生负面影响。

CellBrite® Fix染料还具有在等渗缓冲液中快速简单标记的特点。细胞在用 CellBrite® Fix 标记后可以固定和透化，这与原始的 CellBrite® 染料或 PKH 染料不同，它们不能耐受清洁剂。

DiI (DiIC18(3); 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine) 是一种广泛使用的亲脂性羰花青染料，通过将其两条长 (C18) 烃链插入脂质来标记细胞膜双层。它已被广泛用于神经元的顺行和逆行标记。

Neuro-DiI（也可作为即用型染色溶液，CellBrite® Green提供）由 Biotium 开发，作为 DiI 的替代品。它有两个额外的叔丁基（在染料的每一侧各一个）连接到染料发色团，这在染料中引入了结构灵活性，使其更易溶于有机溶剂和细胞膜。改进的染料在膜中的溶解度使染料分子能够快速分散，比常规 DiI 更快地彼此远离，常规 DiI 具有促进染料聚集的相对平坦的结构，并减慢染料分子的分散。因此，与 DiI 相比，Neuro-DiI 可实现更均匀、快速和稳定的染色。

FAST™ DiI使用不同的策略来溶解染料。用不饱和亚油基链取代常规 DiI 的饱和 C18 亲脂链，使染料分子具有弯曲结构，使其不易聚集，从而更快地分散在膜中。

Neuro-DiI 和 FAST™ DiI 在膜中的扩散速度都比常规 DiI 快，但尚未对两种染料之间的相对扩散速率进行比较。Neuro-DiI 可能比 FAST™ DiI 具有潜在优势。Neuro-DiI 的叔丁基使其比 FAST™ DiI 更具疏水性，可能导致更稳定的膜染色，并降低细胞间染料转移的可能性。

FAST DiI 是 Thermo Fisher Scientific 的商标。

原始CellBrite® 细胞质膜染色剂是亲脂性羰花青染料。当这些染料插入脂质双层时，它们的荧光会增加。亲脂性羰花青染料稳定地标记细胞的质膜和其他细胞内膜。它们还可用于对固定细胞或人工脂质双层进行染色。CellBrite® 细胞质膜染料是亲脂性羰花青染料。当这些染料插入脂质双层时，它们的荧光会增加。亲脂性羰花青染料稳定地标记细胞的质膜和其他细胞内膜。它们也可用于染色人工脂质双层。在对培养的细胞进行染色后，染料立即主要定位于质膜。如果细胞在染色后随着时间的推移培养，标记的膜被内化，染色逐渐变成大部分细胞内。

亲脂性羰花青染料，如我们最初的CellBrite® 细胞质膜染色剂，已被用于对培养的神经元细胞染色数周，并在体内染色长达一年（见下文注释）。这些染料不会明显影响细胞活力，并且不易在具有完整膜的细胞之间转移，从而允许在混合群体中进行细胞迁移和跟踪研究。用共价染料CellBrite® Fix和MemBrite® Fix 染色在组织培养细胞中可持续长达 48 小时（见下面的注释）。

注意：随着时间的推移，所有细胞表面染色剂都将被内化并成为细胞内的细胞膜，因为细胞膜通过内吞作用翻转。内化率可能因细胞类型、膜周转率和细胞分裂率而异。在培养的永生化细胞中，对于 CellBrite®、CellBrite® Fix 和 MemBrite® Fix 染色剂，大部分表面染色会在大约 24 小时内内化。

如需用于长期细胞追踪或追踪混合培养细胞的稳定和可固定染色剂，请参阅我们的ViaFluor® SE 细胞增殖染料。这些染料共价标记整个细胞内的细胞内蛋白质，无毒且可固定。

在用原始CellBrite®或CellBrite® NIR细胞质膜染料标记后，可以用甲醛固定细胞。使用去污剂或溶剂或含有甘油的封固剂对细胞进行透化处理可能会对染色产生不利影响。据报道，洋地黄皂苷（10 ug/mL 至 1 mg/mL）的透化作用与亲脂性羰花青染料染色相容。在用 CellBrite® 染料染色之前对甲醛固定的细胞进行透化处理，我们已经看到了良好的结果。

CF®  Dye WGA Conjugates还可用于标记固定细胞/组织或 FFPE 切片中的细胞表面或质膜。然而，在组织切片上，凝集素会在所有细胞膜、外部（质膜）和内部（细胞器膜）上标记糖蛋白。WGA 染色也可以是组织和细胞类型依赖性的，即它基于细胞膜上糖蛋白的表达模式。

CellBrite® Fix Membrane Stains和MemBrite® Fix Cell Surface Stains属于一类新型膜染料，旨在共价标记细胞表面。它们可以承受固定和透化作用，或在活细胞标记后用酒精固定。CellBrite® Fix 和 MemBrite® Fix 不能用于标记固定细胞或组织的质膜（染料标记固定细胞中的细胞质）。

要为您的工作流程找到合适的染料，请参阅我们的膜和细胞表面染色比较

CellBrite® 和 CellBrite® NIR 细胞质膜染料等亲脂性羰花青染料可用于对甲醛固定细胞进行染色。不建议使用甲醇或其他溶剂进行固定。染色后用洗涤剂透化会提取染料并改变染色模式。然而，当甲醛固定的细胞在用 CellBrite® 染料染色之前进行透化处理时，我们已经看到了良好的结果。

CellBrite® Fix、MemBrite® Fix 和 CellBrite® Steady 不能用于固定样品的质膜染色；这些染料将主要染色已经固定的细胞中的细胞内结构。

要为您的工作流程找到合适的染料，请参阅我们的膜和细胞表面染色比较

需要 CellBrite® Blue 试剂盒中的上样缓冲液来溶解 DiB 染料溶液。其他 CellBrite® 染料的溶解度更高，不需要这样做。

DiB 上样缓冲液 (30024B) 在储存过程中通常会凝固成凝胶。这不会影响产品，但缓冲液在使用前必须呈液态。将凝固的凝胶加热至 50-60°C 并持续 5-10 分钟，并定期涡旋直至形成透明液体。DiB Loading Buffer 是粘性的，所以慢慢吸取它以确保添加正确的体积。

您可以将 DiB Cell Labeling Solution 加热至 37°C 10 分钟或更长时间，然后上下移液或涡旋混合溶液直至完全溶解。

CellBrite® 染料是亲脂性羰花青染料 DiI、DiO 等的即用型溶液。由于 CellBrite® 染料的疏水性，使用 CellBrite® 染料进行统一标记具有挑战性，CellBrite® Red (#30023)，即 DiD，特别适合很难，因为疏水性染料容易聚集并导致染色不均匀。在尝试染色之前，将染料瓶加热至约 50°C 以溶解任何染料聚集体。此外，我们建议先在培养基中稀释（1:200 稀释），然后再将含有染料的培养基加入细胞，而不是直接将染料添加到培养基中。此外，请注意，如果细胞在染色后进行培养，这些染料将被内化。

或者，对于活细胞染色，CellBrite® Steady 或活性染料 CellBrite® Fix 或 MemBrite® Fix 会更合适，因为它们会产生更均匀的染色。

CellBrite®染料与基于甘油的封片剂不兼容，因为这会导致染色改变和高背景。有机堆积介质也不适用。我们建议直接在 PBS（或其他水性缓冲液）中成像。应使用 PBS 安装盖玻片，并用合适的盖玻片密封剂（如CoverGrip™或指甲油）密封。染色样品可在 4°C 下保存在 PBS 中数周或更长时间。

虽然 CellBrite® 细胞质膜染料可以对甲醛固定的细胞进行染色，但它们在冷冻切片中通常效果不佳，这可能是因为细胞膜的完整性被破坏，将其他膜结构暴露在染料中。一些客户报告称，在振动切片机切片中使用这些染料取得了成功。

CellBrite® 细胞质膜染料不适用于 FFPE 样品的膜染色，因为在脱蜡和再水化过程中会提取膜脂。同样，冰冻切片的丙酮或甲醇固定会提取脂质，导致染色效果不佳。

CellBrite® Fix、MemBrite® Fix 和 CellBrite® Steady 仅推荐用于活细胞。在固定的细胞或切片中，它们将标记细胞内结构。

在某些组织类型中，CF® Dye WGA Conjugates、CF® Dye Concanavalin A Conjugates或CF® Dye PNA Conjugates 等凝集素可用于染色 FFPE 或冰冻切片中的细胞边界。然而，凝集素的染色模式高度依赖于细胞和组织类型，因此我们建议在为您感兴趣的组织尝试这些染色之前先查阅文献。

或者，可以使用细胞表面特异性抗体进行免疫染色。

到目前为止，我们还没有找到适用于组织切片的通用质膜染色剂。这是我们和我们的客户感兴趣的应用程序，因此我们正在努力寻找新的解决方案。

亲脂性 CellBrite® 染料不适用于溶剂透明样品，因为膜脂会在溶剂处理步骤中被提取出来。活性膜染料、CellBrite® fix 和 MemBrite® 也不起作用，因为它们是活细胞染色剂，而在死/固定样品中，它们会染色所有可接近的目标，从而导致全细胞染色。

但是，如果可以对活细胞进行染色，则可以在固定和溶剂清除之前使用反应性 CellBrite® fix 和 MemBrite® fix 膜染料，但这些染料可能无法有效渗透多层细胞或组织。

使用CF® Dye WGA Conjugates染色可能是一种选择，但染色可能取决于细胞和组织类型，即它基于细胞膜上糖蛋白的表达模式。您可以根据已发表的文献验证 WGA 染色是否适合您的细胞或组织类型。同样重要的是要注意，如果使用组织切片，凝集素会在所有细胞膜、外部（质膜）和内部（细胞器膜）上染色糖蛋白。

或者，可以使用使用细胞表面特异性抗体的免疫染色。

要为您的工作流程找到合适的染料，请查看以下链接：

膜和细胞表面染色的比较

CellBrite® 细胞质膜染料等亲脂性羰花青染料可能会对组织切片或器官培养物进行染色，但由于它们的亲脂性，它们可能不会穿透厚组织切片中的多个细胞层。这些染料已用于类器官中的细胞追踪和标记水凝胶培养物。然而，对于这种应用，通常在将细胞置于类器官培养物或嵌入水凝胶之前对细胞进行标记。

这类染料已广泛用于生物体、组织切片、果蝇胚胎和鸡胚胎的神经元追踪，通过显微注射或用固体染料晶体进行点标记。神经元追踪也可以在甲醛固定的组织或胚胎中进行。

Matrigel 是康宁公司的注册商标。

CF® Dye WGA Conjugates、CF® Dye Concanavalin A Conjugates或CF® Dye PNA Conjugates 等凝集素可用于标记 FFPE 或冷冻切片中的细胞表面或质膜。然而，凝集素会在所有细胞膜、外部（质膜）和内部（细胞器膜）上标记糖蛋白。凝集素染色也依赖于组织和细胞类型，基于细胞膜上糖蛋白的表达模式。因此，它们通常不会选择性地标记组织切片中的所有细胞轮廓或边界。

其他细胞表面膜染色剂（如亲脂性CellBrite®或CellBrite® NIR染料）不适用于 FFPE 样品的膜染色，因为在脱蜡和再水化过程中会提取膜脂。同样，冰冻切片的丙酮或甲醇固定会提取脂质，导致染色效果不佳。

CellBrite® 细胞质膜染料可能会对甲醛固定的冷冻切片染色。然而，由于冷冻切片中细胞膜的完整性被破坏，CellBrite® 染料可能不会选择性地染色组织切片中的质膜，而且可能还会染色细胞内结构。

反应性可固定膜染色剂CellBrite® Fix和MemBrite® Fix仅适用于活细胞染色。在固定切片中，它们会不分青红皂白地与整个细胞中的目标蛋白发生反应，从而对整个细胞进行染色。

或者，可以使用细胞表面特异性抗体进行免疫染色。

要为您的工作流程找到合适的染料，请参阅我们的 膜和细胞表面染色比较。

CellBrite® 和 MemBrite® Stains 最初是为培养中的哺乳动物细胞染色而开发的，但一些染色剂也已针对其他生物体和应用进行了验证。对于染色酵母或细菌膜的染料，请参阅不同生物体的细胞染色。

CellBrite®细胞质膜染料不染色细菌。活性CellBrite® Fix 染料可染色革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，而MemBrite® Fix染料仅染色革兰氏阳性细菌。然而，我们还没有测试这些染料在细菌中的细胞分裂追踪。

有文献描述了使用 CFSE 追踪细菌细胞分裂，ViaFluor® SE细胞增殖染料可能以类似的方式起作用，但我们尚未对此进行测试。

是的，CellBrite® 细胞质膜染料染色可以在缓冲液而不是培养基中进行。如果您要对贴壁细胞进行染色，我们建议使用含钙/镁的 HBSS 等缓冲液，这有助于维持细胞贴壁和形态。

CellBrite® 和 MemBrite® Stains 最初是为培养中的哺乳动物细胞染色而开发的，但一些染色剂也已针对其他生物体和应用进行了验证。对于染色酵母或细菌膜的染料，请参阅不同生物体的细胞染色。

是的，CellBrite® 细胞质膜染料染色可以在室温或更低温度下进行，而不是 37°C，这可能会减少染色过程中染料的内化。请注意，在 4°C 下染色可能会导致染料沉淀或染色不均匀。

CellBrite® 和 MemBrite® Stains 最初是为培养中的哺乳动物细胞染色而开发的，但一些染色剂也已针对其他生物体和应用进行了验证。对于染色酵母或细菌膜的染料，请参阅不同生物体的细胞染色。

请参阅下文，了解我们推荐的 Akoya tyramides 替代品。除非注明为直接替代品，否则这些酪胺染料是光谱相似的替代品。它们尚未经过验证可直接替代 Akoya 试剂盒或成像系统。

CF® Dye Alternatives for Akoya Tyramides

注意：此处列出的 CF® 染料是 Opal™ 染料的光谱相似替代品，它们尚未经过验证可直接替代 Akoya 的试剂盒或成像系统。Opal 是 Akoya Biosciences 的商标。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数日，因此产品很可能仍能正常工作。为了安全起见，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前，先进行小规模的阳性对照实验，以确认该产品仍然适用于您的应用。

我们知道的一个例外是 GelGreen™，它比我们大多数其他荧光染料对光照更敏感。如果 GelGreen™ 长时间（数天至数周）暴露在环境光下，其颜色将从深橙色变为砖红色。如果发生这种情况，GelGreen 将不再适用于凝胶染色。

生物科学试剂盒
产品信息表上列出了自收到生物科学试剂盒之日起保证的保质期。一些套件在套件盒标签上印有有效期，这是从产品从我们工厂发货之日算起的保证保质期。套件的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧试剂盒，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该试剂盒仍适用于您的应用。

抗体和其他偶联物
产品信息表上列出了抗体和偶联物自收货之日起的保证保质期。抗体和其他结合物的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧偶联物，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该产品仍适用于您的应用。

对于冻干抗体，我们建议用甘油和抗菌防腐剂（如叠氮化钠）重构抗体以获得最长的保质期（请注意，叠氮化钠与 HRP 偶联物不相容）。

化学品、染料和凝胶染色剂
Biotium 保证化学品、染料和凝胶染色剂在您收到产品之日起至少一年内保持稳定。然而，只要按照建议储存，这些产品中的大多数在多年内都非常稳定。存储条件可在产品信息表或产品安全和数据表、材料安全数据表以及产品标签上找到。荧光化合物应避光以便长期储存。

如果您希望使用已储存超过一年的 Biotium 化合物，我们建议您进行小规模阳性对照实验，以确认该化合物在处理大量样品或珍贵样品之前仍适用于您的应用样品。

基于生产日期的有效期 (DOM)
如果您的机构要求您记录基于试剂生产日期的有效期，请联系 techsupport@biotium.com 寻求帮助。

有特殊稳定性考虑的化工产品：

酯类

酯类化合物包括：
• 琥珀酰亚胺酯（SE，也称为 NHS 酯），例如我们的胺反应性染料
• 乙酰氧基甲基酯（AM 酯），例如我们的膜渗透性离子指示剂染料
• 二乙酸酯改性染料，例如 ViaFluor ™ 405、CFDA 和 CFDA-SE 细胞活力/细胞增殖染料

只要避光和防潮，酯类染料在固体形式下是稳定的。酯在水溶液中不稳定。应在无水 DMSO中制备浓缩储备液（参见 Biotium 目录号90082）。无水 DMSO 中的储备液可在 -20°C 下干燥保存一个月或更长时间。酯类应在使用前立即用水溶液稀释。琥珀酰亚胺酯 (SE) 应溶解在不含会与 SE 官能团反应的含胺化合物（如 Tris、甘氨酸或蛋白质）的溶液中。AM 酯和二乙酸化合物应溶解在不含血清的溶液中，因为血清可能含有会水解该化合物的酯酶。

关于 CF® 染料琥珀酰亚胺酯稳定性的说明

琥珀酰亚胺酯 (SE) 通常容易水解，从而导致标记效率降低。许多用于生命科学研究的市售荧光染料都是高度磺化的染料，这使得它们特别容易吸湿，从而加剧了水解问题。此外，对于几种市售的 SE 活性染料，SE 基团衍生自芳香族羧酸，而 Biotium 的所有 CF® 染料中的 SE 基团均由脂肪族羧酸制备。这种结构差异降低了 CF® Dye SE 反应基团对水解的敏感性，从而产生相对稳定的活性染料，与其他荧光染料的其他 SE 衍生物相比，标记效率始终更高。

马来酰亚胺、MTS 和硫代硫酸盐染料
与琥珀酰亚胺酯染料一样，这些染料也容易水解，尽管水解程度通常要低得多。因此，对于长期储存，建议使用无水 DMSO 制备储备液。

其他活性染料
胺类、氨氧基（也称为甲醛）、酰肼、叠氮化物、炔烃、BCN 和酪胺类活性染料，以及染料游离酸，在-20°C 下储存 6-12 年时通常在水溶液中稳定几个月或更长时间，只要不存在可能与染料的官能团发生反应的化合物。有关特定活性染料的更多信息，请参阅产品信息表。

腔肠素和 D-荧光素

按照建议储存时，腔肠素以固体形式稳定；它们在水溶液中不稳定。应在乙醇或甲醇中制备浓缩腔肠素储备液（通常为 1-100 mg/mL）；不要使用 DMSO 或 DMF 溶解腔肠素，因为这些溶剂会氧化化合物。腔肠素的乙醇或甲醇库存可在 -20°C 或以下储存六个月或更长时间；酒精储备在储存过程中可能会蒸发，因此请使用密封的螺旋盖小瓶并用封口膜包裹小瓶以进行长期储存。丙二醇也可用作溶剂以减少蒸发。如果溶剂蒸发，腔肠素仍会存在于小瓶中，因此在储存前记下小瓶中的体积，以便您可以根据需要调整溶剂体积以校正蒸发。使用前立即在水性缓冲液中制备工作溶液。腔肠素在水溶液中最多可稳定 5 小时。

Aquaphile™ 腔肠素是腔肠素的水溶性制剂。当按照建议储存时，它们以固体形式稳定。Aquaphile™ 腔肠素应在使用前立即溶解在水溶液中。它们在水溶液中最多可稳定 5 小时。

请注意，腔肠素主要是黄色固体，但可能含有深红色或棕色斑点。这不会影响产品稳定性或性能。如果您的腔肠素呈均匀的棕色，则说明它已被氧化，需要更换。

D-荧光素在固体形式下是稳定的，并且在按照建议储存时作为浓缩储备液；它在水溶液中的稀释工作浓度下不稳定。在水中制备浓缩的 D-荧光素储备溶液（通常为 1-100 mg/mL），并在 -20°C 或更低温度下分装储存六个月或更长时间。使用前立即准备工作解决方案。

带有多个负电荷的染料会引入背景。通常，与金环蛇毒素等小毒素相比，携带许多染料的标记抗体更值得关注。对组织进行染色时，组织本身的内源性自发荧光通常是最重要的背景来源。组织中的内源性荧光背景通常在蓝色波长（DAPI 通道）中最高，在远红色（Cy®5 通道）中最低。我们的 CF®633 金环蛇毒素（目录号 00009）是 Cy®5 通道的远红外结合物，具有低负电荷，染料或自发荧光的背景应该很低。

我们在大鼠骨骼肌切片上测试了荧光银环蛇毒素。虽然组织显示自发荧光，但对于我们测试过的所有染料颜色，马达终板的银环蛇毒素染色通常比背景亮得多。但是，如果您对人体组织（尤其是大脑）进行染色，脂褐素自发荧光可能在所有通道中都很亮。这通常表现为细胞核周围明亮的点状点。虽然我们通常会推荐将我们的 TrueBlack® 脂褐素猝灭剂用于人脑组织，但它们与银环蛇毒素染色不兼容。然而，我们发现EverBrite TrueBlack® 封片剂（货号 23017）可用于封片被银环蛇毒素染色的骨骼肌切片。

Cy Dye 是 Cytiva 的注册商标。

CF® 染料的确切化学结构目前处于保密状态，但将在稍后获得待批专利时全面披露。一般而言，CF® 染料的结构可分为两部分：a) 染料核心结构（即定义染料颜色或吸收/发射波长的芳香环骨架），以及 b) 核心结构修饰元素。目前，CF®染料的核心结构为香豆素、芘、罗丹明或花青染料。蓝色荧光 CF® 染料基于香豆素或芘染料核心结构，而绿色至近红外 CF® 染料基于花青或罗丹明染料核心结构。核心结构修饰元素是指核心结构的各种化学附件，是 CF® 染料发明的一个关键方面，它使 CF® 染料优于其他商业染料。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数天，但我们建议在 4°C 或 -20°C 下储存以延长保质期。对于我们的许多染料水溶液，这些化合物在室温下非常稳定，但我们建议冷藏以防止霉菌或其他微生物随着时间的推移而生长。因此，为节省运输成本，建议在 4°C 或 -20°C 下储存的产品可以在环境温度下或使用冰袋运输。这些产品可能会解冻而不影响产品性能。当您收到产品时，请将其置于推荐的存储条件下。

一些产品随附蓝色冰袋作为额外的高温预防措施。蓝色冰袋可在到达时解冻，而不会影响产品性能。

建议在超低温 (-70°C) 下储存并使用干冰运输的产品应以冷冻形式送达。

大多数 CF® 染料带有 1-2 个负电荷，而一些基于花青的近红外 CF® 染料带有 3-4 个负电荷。然而，带更多负电荷的 CF® 染料具有独特的结构特征，可以屏蔽负电荷，因此染料标记的生物分子（例如抗体）不会因过多的负电荷而失去特异性。

CF® 最初是基于花青的荧光染料的缩写。这些是第一个获得专利的基于花青染料结构的 CF® 染料。从那时起，我们的 CF® 染料专利组合已经扩展到包括四种不同的荧光染料核心结构，涵盖从 UV 到 NIR 的荧光光谱。

CF® 染料具有高度水溶性 (>100 mg/mL)。它们也极易溶于其他极性溶剂，例如 DMSO、DMF、甲醇和乙醇。然而，CF® 染料在非极性溶剂中溶解性差或不溶。

基于罗丹明的 CF® 染料（指定为 R）通常比基于花青的等效物（指定为 C）具有更好的光稳定性，但荧光更弱。因此，基于罗丹明的近红外 CF® 染料是显微镜的更好选择，而基于花青的 CF® 染料更适用于流式细胞术、蛋白质印迹和其他光漂白不太受关注的应用。另一个要考虑的因素是染料的大小。一些基于花青的近红外 CF® 染料比基于罗丹明的等效染料大得多。对于抗体标记，两种版本的 CF® 染料均适用。然而，对于染料尺寸可能导致空间问题的应用，较小的染料可能是更好的选择。

我们没有关于 LSM 800 上用于 6 色成像的 CF 染料的直接经验或客户反馈，但由于该仪器具有可调谐激发和线性分离，因此您在染料选择上应该有很大的灵活性。我们还建议联系蔡司支持人员，看看他们是否有关于为仪器的多色实验选择染料的建议。

紫色激发的 405/430 染料通常不太亮，应该用于更丰富的目标。754 染料也推荐用于更丰富的目标。即使在最佳激发条件下，Zeiss LSM 880 上的 GaAsp 检测器预计对 NIR 波长的响应也会降低。其他染料非常明亮，更适合不太丰富的目标，以最大限度地减少串扰。

下面我们列出了我们通常推荐用于 LSM 880 上的标准激光线的染料。

405 nm 激光线

CF®405S，Ex/Em 404/431 nm；推荐用于丰富的目标

458 nm 激光线

CF®430，Ex/Em 426/498 nm；推荐用于丰富的目标

488 nm 激光线

CF®488A，Ex/Em 490/515 nm；明亮且耐光

注意：CF®488A和CF®514如果一起使用必须通过光谱成像分离

514 nm 激光线       

CF®514，Ex/Em 516/548 nm；光谱成像染料

注意：CF®488A和CF®514如果一起使用必须通过光谱成像分离

561 nm 激光线

CF®568 Ex/Em 562/583 纳米；非常明亮且耐光

注意：CF®568和CF®594如果一起使用必须通过光谱成像分离

594 nm 激光线

CF®594，Ex/Em：593/614 nm；非常明亮且耐光

注意：CF®568和CF®594如果一起使用必须通过光谱成像分离

633 nm 激光线

CF®640R，Ex/Em 642/662 nm；CF®640 在中心激发下会更亮

CF®660R，Ex/Em 663/682 nm；CF®660R 偏心于该激光器，但非常明亮且光稳定性极佳；不太可能与 CF®594 发生串扰

可调谐 2P 激光器 720-1020

CF®754，Ex/Em 745/786；推荐用于丰富的目标（LSM800 检测器预计对 NIR 染料不太敏感）

所有这三种染料都可以被 405 nm 激光（或紫外汞灯）激发。它们的发射波长不同。CF®405S 在 431 nm 发射蓝色荧光，类似于 AlexaFluor® 405、Cascade Blue® 和 DyLight™ 405 (Thermo Scientific)。CF®405M 在 452 nm 处具有更长波长的蓝色荧光发射，类似于 Horizon™ V450 (BD Biosciences) 和 Pacific Blue® (Thermo Scientific)。CF®405L 在 545 nm 处有橙色荧光发射，类似于 Pacific Orange® (Thermo Scientific)。我们建议选择最适合您仪器检测设置的染料。

染料稳定性通常包括三个方面：1）染料核心结构的化学稳定性；2）反应基团的稳定性；3) 染料的光稳定性。

染料核心结构的化学稳定性：

这是指染料核心结构对由光漂白以外的因素引起的分解的抵抗力。这些因素可能包括温度、pH 值以及与介质中其他化学物质的不相容性。这种类型的稳定性信息对于估计已经共价连接到另一个分子（例如抗体）的染料的保质期或评估染料在某些应用中的化学相容性最有用。CF® 染料具有香豆素、芘、罗丹明或花青染料的核心结构，众所周知，所有这些都具有出色的化学稳定性。一般来说，CF® 染料比它们标记的抗体稳定得多。因此，如果 CF® 标记的抗体在储存期间失去活性，则问题不太可能是由染料引起的。

反应基团的稳定性：

反应性 CF® 染料包含用于生物偶联的反应基团。在各种反应性基团中，只有胺反应性琥珀酰亚胺酯 (SE) 和硫醇反应性马来酰亚胺基团不稳定，因为包装小瓶中残留或泄漏的少量水分会随着时间的推移导致反应性基团水解。SE 组尤其容易降解。因此，为了减缓降解，包含这些反应基团的 CF® 染料必须在 -20°C 的无水条件下储存。此外，染料的储备溶液必须使用干燥溶剂（例如无水 DMSO）制备。CF® Dye SE 产品相对于其他商业染料的优势之一是它们的稳定性相对较高。通常，SE基团可以衍生自脂肪族或芳香族羧酸基团，但脂肪族羧基往往会产生更稳定的 SE，提供更高的抗水解性，从而提高标记效率。所有 CF® SE 染料的 SE 基团都源自脂肪族羧酸基团，这与许多通常由芳香族羧酸基团制备的市售 SE 染料不同。

耐光性：

这是指染料承受光漂白的能力。对于大多数染料，光稳定性对于环境光下的常规处理或应用（如流式细胞术和蛋白质印迹，其中染料仅短暂暴露在光下）不是主要问题。然而，对于显微镜，尤其是共聚焦显微镜，染料可能会长时间受到强烈照射，因此光漂白可能是一个主要问题。与其他荧光染料的光稳定性类似，染料核心结构和与其相连的结构修饰基团都对 CF® 染料的光稳定性起作用。CF® 染料具有罗丹明、花青、芘或香豆素染料的核心结构；在四种核心结构中，罗丹明核心最耐光，其次是花青，然后是芘和香豆素核心。结构修饰基团及其与染料核心的连接方式是 CF® Dye 技术的一个关键创新方面，有助于 CF® Dyes 优于其他商业染料的光稳定性。一般来说，基于罗丹明的 CF® 染料的波长范围从可见光到近红外区域，具有最佳的光稳定性，使该染料成为显微镜应用的理想选择。

CF® 染料在至少 2 –11 的 pH 范围内具有化学稳定性。大多数 CF® 染料的荧光对 pH 值相对不敏感，但 CF®405M、CF®568、CF®620R 和 CF®633 除外。当 pH 值降至 4.5 以下时，这四种 CF® 染料的荧光会变弱。

CF® 染料可以耐受甲醛固定。然而，CF®染料标记的探针是否可固定将取决于探针本身的可固定性。具有结合其他蛋白质的游离胺基的蛋白质通常是甲醛可固定的。

这个问题没有简单的答案，因为荧光染料的量子产率可能有很大差异，具体取决于染料的微环境。例如，附着在蛋白质上的染料的量子产率可能与游离染料的量子产率非常不同。对于附着在蛋白质上的染料，量子产率高度依赖于有多少染料分子附着在蛋白质上（即蛋白质标记的程度）。一般来说，较高程度的蛋白质标记会导致较低的染料量子产率，这是由于染料与染料之间的相互作用会导致荧光猝灭。因此，随着标记程度的增加，标记蛋白的荧光强度最终会达到最大值，然后开始下降。实际上，比较不同染料的相对量子产率的最佳方法之一是绘制标记蛋白质的总荧光作为染料标记程度的函数，就像我们对 CF® 染料和其他商业染料所做的那样。CF® 染料通常比图中的其他商业染料具有更高的斜率，表明随着蛋白质标记程度的增加，量子产率下降较少。

可获得多种 CF® 染料的寿命数据，包括缓冲液中的游离染料以及相应的 CF® 染料偶联二抗。下面列出了这些。

测量是在德国徕卡显微系统公司提供的 Stellaris 8 STED FALCON 显微镜上进行的。§ CF® 染料标记的抗小鼠二抗的荧光寿命测量，用于使用小鼠抗微管蛋白 (DM1a) 对 U2OS 中的微管进行免疫染色，并安装在 ProLong™ Diamond 中。*在不同的实验条件和成像设置下通过客户沟通获得的寿命数据。

CF® 染料是蛋白质标记的理想选择，因为它们具有高水溶性，可减少荧光猝灭。它们也可用于标记需要多个染料拷贝以获得最大荧光的寡核苷酸，例如 FISH 探针的制备，其中水溶性染料可以最大限度地减少荧光猝灭。最后，CF® 染料可制成出色的极性示踪剂，可用于显微注射后神经元的形态可视化或长期示踪。CF® 染料及其偶联物是荧光显微镜应用、流式细胞术、蛋白质印迹和体内成像（近红外 CF® 染料）的理想选择。

用于生物原醇共轭（点击化学）的活性染料包括炔烃、叠氮化物、BCN、TCO 和甲基四嗪，可用于制备聚合物。我们目前不提供 CF 染料甲基丙烯酸酯。

Yes, CF® dye tyramides can be used for in situ hybridization using Tyramide Signal Amplification1 (TSA). They are also compatible with the RNAscope assays  for RISH2.

1 doi: https://doi.org/10.1038/s41598-018-38171-5.

2 doi: http://dx.doi.org/10.1101/651083.

如果您订购一端带有氨基的寡核苷酸合成，那么我们的CF® Dye 琥珀酰亚胺酯 (SE) 染料可用于使用标准的 DNA 胺标记方案对其进行标记。

我们建议使用 HPLC 纯化的寡聚物，其氨基在 5' 或 3' 端带有 C6 接头。要在标记后去除游离染料，您可以使用 G25 Sephadex、凝胶纯化、乙醇沉淀或 HPLC，具体取决于所需的纯度。

或者，这可能是寡核苷酸合成公司可以为您执行的自定义标记操作。

我们没有 LPS 标记的第一手经验，但根据文献，LPS 已使用胺反应染料（如 FITC）进行标记。我们的胺反应性CF® 染料琥珀酰亚胺酯也适用于此。有一篇关于使用染料酰肼对 LPS 进行酶促标记的出版物。我们的CF® 染料酰肼可用于该方法。该论文还描述了传统的胺标记方法和偶联物的纯化。

对于冻干（固体）形式提供的染料或试剂，很难根据试管中染料的外观来比较数量，因为在冻干过程中，染料会以不同的方式干燥，要么散布在整个试管中，聚集在一起，或涂在管的侧面或底部。离心管可能无助于将染料固体收集到管底，因为这通常适用于溶液。然而，冻干固体是根据干燥前试剂溶液的高精度吸光度测量进行包装的，因此小瓶中含有正确数量的染料。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数日，因此产品很可能仍能正常工作。为了安全起见，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前，先进行小规模的阳性对照实验，以确认该产品仍然适用于您的应用。

我们知道的一个例外是 GelGreen™，它比我们大多数其他荧光染料对光照更敏感。如果 GelGreen™ 长时间（数天至数周）暴露在环境光下，其颜色将从深橙色变为砖红色。如果发生这种情况，GelGreen 将不再适用于凝胶染色。

请注意，AccuBlue® NextGen 的最佳激发和发射最大值为 468/507 nm，这与其他 AccuBlue® 染料不同。可能需要调整荧光板阅读器的增益设置以获得最佳信号背景。

生物科学试剂盒
产品信息表上列出了自收到生物科学试剂盒之日起保证的保质期。一些套件在套件盒标签上印有有效期，这是从产品从我们工厂发货之日算起的保证保质期。套件的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧试剂盒，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该试剂盒仍适用于您的应用。

抗体和其他偶联物
产品信息表上列出了抗体和偶联物自收货之日起的保证保质期。抗体和其他结合物的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧偶联物，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该产品仍适用于您的应用。

对于冻干抗体，我们建议用甘油和抗菌防腐剂（如叠氮化钠）重构抗体以获得最长的保质期（请注意，叠氮化钠与 HRP 偶联物不相容）。

化学品、染料和凝胶染色剂
Biotium 保证化学品、染料和凝胶染色剂在您收到产品之日起至少一年内保持稳定。然而，只要按照建议储存，这些产品中的大多数在多年内都非常稳定。存储条件可在产品信息表或产品安全和数据表、材料安全数据表以及产品标签上找到。荧光化合物应避光以便长期储存。

如果您希望使用已储存超过一年的 Biotium 化合物，我们建议您进行小规模阳性对照实验，以确认该化合物在处理大量样品或珍贵样品之前仍适用于您的应用样品。

基于生产日期的有效期 (DOM)
如果您的机构要求您记录基于试剂生产日期的有效期，请联系 techsupport@biotium.com 寻求帮助。

有特殊稳定性考虑的化工产品：

酯类

酯类化合物包括：
• 琥珀酰亚胺酯（SE，也称为 NHS 酯），例如我们的胺反应性染料
• 乙酰氧基甲基酯（AM 酯），例如我们的膜渗透性离子指示剂染料
• 二乙酸酯改性染料，例如 ViaFluor ™ 405、CFDA 和 CFDA-SE 细胞活力/细胞增殖染料

只要避光和防潮，酯类染料在固体形式下是稳定的。酯在水溶液中不稳定。应在无水 DMSO中制备浓缩储备液（参见 Biotium 目录号90082）。无水 DMSO 中的储备液可在 -20°C 下干燥保存一个月或更长时间。酯类应在使用前立即用水溶液稀释。琥珀酰亚胺酯 (SE) 应溶解在不含会与 SE 官能团反应的含胺化合物（如 Tris、甘氨酸或蛋白质）的溶液中。AM 酯和二乙酸化合物应溶解在不含血清的溶液中，因为血清可能含有会水解该化合物的酯酶。

关于 CF® 染料琥珀酰亚胺酯稳定性的说明

琥珀酰亚胺酯 (SE) 通常容易水解，从而导致标记效率降低。许多用于生命科学研究的市售荧光染料都是高度磺化的染料，这使得它们特别容易吸湿，从而加剧了水解问题。此外，对于几种市售的 SE 活性染料，SE 基团衍生自芳香族羧酸，而 Biotium 的所有 CF® 染料中的 SE 基团均由脂肪族羧酸制备。这种结构差异降低了 CF® Dye SE 反应基团对水解的敏感性，从而产生相对稳定的活性染料，与其他荧光染料的其他 SE 衍生物相比，标记效率始终更高。

马来酰亚胺、MTS 和硫代硫酸盐染料
与琥珀酰亚胺酯染料一样，这些染料也容易水解，尽管水解程度通常要低得多。因此，对于长期储存，建议使用无水 DMSO 制备储备液。

其他活性染料
胺类、氨氧基（也称为甲醛）、酰肼、叠氮化物、炔烃、BCN 和酪胺类活性染料，以及染料游离酸，在-20°C 下储存 6-12 年时通常在水溶液中稳定几个月或更长时间，只要不存在可能与染料的官能团发生反应的化合物。有关特定活性染料的更多信息，请参阅产品信息表。

腔肠素和 D-荧光素

按照建议储存时，腔肠素以固体形式稳定；它们在水溶液中不稳定。应在乙醇或甲醇中制备浓缩腔肠素储备液（通常为 1-100 mg/mL）；不要使用 DMSO 或 DMF 溶解腔肠素，因为这些溶剂会氧化化合物。腔肠素的乙醇或甲醇库存可在 -20°C 或以下储存六个月或更长时间；酒精储备在储存过程中可能会蒸发，因此请使用密封的螺旋盖小瓶并用封口膜包裹小瓶以进行长期储存。丙二醇也可用作溶剂以减少蒸发。如果溶剂蒸发，腔肠素仍会存在于小瓶中，因此在储存前记下小瓶中的体积，以便您可以根据需要调整溶剂体积以校正蒸发。使用前立即在水性缓冲液中制备工作溶液。腔肠素在水溶液中最多可稳定 5 小时。

Aquaphile™ 腔肠素是腔肠素的水溶性制剂。当按照建议储存时，它们以固体形式稳定。Aquaphile™ 腔肠素应在使用前立即溶解在水溶液中。它们在水溶液中最多可稳定 5 小时。

请注意，腔肠素主要是黄色固体，但可能含有深红色或棕色斑点。这不会影响产品稳定性或性能。如果您的腔肠素呈均匀的棕色，则说明它已被氧化，需要更换。

D-荧光素在固体形式下是稳定的，并且在按照建议储存时作为浓缩储备液；它在水溶液中的稀释工作浓度下不稳定。在水中制备浓缩的 D-荧光素储备溶液（通常为 1-100 mg/mL），并在 -20°C 或更低温度下分装储存六个月或更长时间。使用前立即准备工作解决方案。

AccuGreen™ 套件专为与 Qubit® 荧光计配合使用而设计。所有其他试剂盒均设计用于与 96 孔荧光酶标仪配合使用。我们的定量试剂盒能够检测的 dsDNA 浓度范围各不相同。一些试剂盒还具有不同的荧光激发/发射。访问 DNA 定量试剂盒技术页面或参考下表进行选择。

所有 DNA 和 RNA 定量试剂盒

* 标准测定体积为 200 uL
** AccuBlue® NextGen 检测限在 1 pg 至 5 pg 范围内，具体取决于仪器灵敏度

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数天，但我们建议在 4°C 或 -20°C 下储存以延长保质期。对于我们的许多染料水溶液，这些化合物在室温下非常稳定，但我们建议冷藏以防止霉菌或其他微生物随着时间的推移而生长。因此，为节省运输成本，建议在 4°C 或 -20°C 下储存的产品可以在环境温度下或使用冰袋运输。这些产品可能会解冻而不影响产品性能。当您收到产品时，请将其置于推荐的存储条件下。

一些产品随附蓝色冰袋作为额外的高温预防措施。蓝色冰袋可在到达时解冻，而不会影响产品性能。

建议在超低温 (-70°C) 下储存并使用干冰运输的产品应以冷冻形式送达。

AccuGreen™ DNA 定量试剂盒设计用于 Qubit® 荧光计。AccuGreen ™ 高灵敏度 DNA 定量试剂盒可直接替代 Thermo Fisher Scientific 的 Qubit® dsDNA HS 检测试剂盒。AccuGreen ™ 宽范围 DNA 定量试剂盒可替代 Thermo Fisher Scientific 的 Qubit® dsDNA BR 检测试剂盒。

AccuBlue® Broad Range RNA Quantitation针对使用预编程 RNA Broad Range 程序的 Qubit® 荧光计进行了优化。它还可以与配备检测远红外荧光（Ex/Em 630/660 nm）的荧光酶标仪一起使用。该试剂盒具有 5-1000 ng RNA 的宽线性范围，涵盖了 Thermo Fisher Scientific 的 Quant-iT™ RNA 和 Quant-iT™ RNA Broad Range 试剂盒。

AccuClear® 和 AccuBlue® DNA 定量试剂盒设计用于荧光 96 孔板读取器。AccuClear®、AccuBlue® NextGen和AccuBlue® High Sensitivity试剂盒需要配备读取绿色荧光发射（类似于 FITC）的仪器。这些测定也可与荧光计一起使用，例如 Qubit® (Thermo Scientific) 和 QuantiFluor®-P (Promega)。然而，由于检测的线性范围不同，并非所有这些检测都与这些仪器上预编程的 DNA 定量程序兼容。对于拥有 Qubit® 荧光计的用户，我们建议使用专为该仪器设计的 AccuGreen™ 套件。

AccuBlue® Broad Range Kit需要配备读取蓝色荧光（Ex/Em 350/460 nm）的仪器。

<div> Quant-iT 和 Qubit 是 Thermo Fisher Scientific 的商标或注册商标。QuantiFluor 是 Promega 的注册商标。</div>

要在酶标仪上检测皮克水平的 DNA，我们推荐我们的AccuBlue® NextGen dsDNA 定量试剂盒（检测范围 2.5 pg-3 ng dsDNA），它在 96 孔测定格式中具有比 PicoGreen® 更高的准确性和灵敏度。

另请参阅我们的AccuClear® 超高灵敏度 dsDNA 定量试剂盒，这是一个很好的通用选择：它具有高灵敏度和广泛的线性检测范围（30 pg-250 ng dsDNA）。

AccuBlue® Broad Range RNA Quantitation具有 5-1000 ng RNA 的宽线性范围，涵盖了 Thermo Fisher Scientific 的 Quant-iT™ RNA 和 Quant-iT™ RNA Broad Range 试剂盒。它可与配备用于检测远红外荧光（Ex/Em 630/660 nm）的荧光酶标仪一起使用，或与 Qubit® RNA Broad Range 程序一起使用。

如果您拥有 Qubit® 荧光计，我们推荐以下专为与 Qubit® 配合使用而设计的试剂盒：
AccuGreen™ 高灵敏度 dsDNA 定量试剂盒 可直接替代 Qubit® dsDNA HS 检测试剂盒。
AccuGreen™ 宽范围 dsDNA 定量试剂盒可替代 Qubit® dsDNA BR 检测试剂盒。
AccuBlue® Broad Range RNA Quantitation针对使用预编程 RNA Broad Range 程序的 Qubit® 荧光计进行了优化。

请注意，试剂盒灵敏度的下限可能取决于所使用的检测仪器。

<div>Quant-iT、Qubit 和 PicoGreen 是 Thermo Fisher Scientific 的商标或注册商标。</div>

定量试剂盒包含定量溶液成分和预稀释的小牛胸腺 DNA 标准品。定量溶液包含定量溶液成分，不包括 DNA 标准品。

不可以。建议使用与您的样本最相似的 DNA 标准品。例如，对于细菌 DNA 定量，您可能更喜欢使用 lambda DNA 作为标准。

是的，对于某些套件。您可以单独购买一套 AccuBlue® 高灵敏度标准液（目录号 31006C）或 AccuBlue® 宽范围标准液（目录号 31007C）。我们提供 25 ng/uL DNA 标准品（货号 31029C），这是 AccuClear® 超高灵敏度检测的最高标准品。我们还提供 1 mg/mL 无 RNase DNA（货号 31065）。

染料对 dsDNA 具有选择性；然而，与 RNA 和 ssDNA 有一些结合。因此，为了获得最准确的定量，建议使用尽可能干净的 dsDNA 制剂。有关 RNA 和 ssDNA 结合的详细信息，请参阅产品信息表。

为最大限度地降低成本，试用装试剂盒附带单一 DNA 标准溶液和通过稀释制备一组标准品的说明。大多数全尺寸套件都配有准备好的标准套件。AccuBlue® NextGen 试剂盒是个例外，它随附 10 ng/uL 的单一标准品，并附有将其稀释至检测中使用的较低浓度的说明。我们发现较低浓度的 DNA 不够稳定，无法长期储存。

AccuBlue® 高灵敏度染料是活细胞不可透过的膜，而 PicoGreen® 已被证明很容易进入细胞。我们尚未使用其他 DNA 定量试剂盒中的染料进行此类测试。

It is highly recommended to minimize cross-over of signals between wells. Depending on your instrument, you can use all black plates or plates with black-walls and clear bottoms.

除了 DNA 定量染料外，我们的一些 DNA 定量试剂盒还包含增强剂。这些试剂盒已使用增强剂进行了优化，以保持灵敏度和线性度。省略增强子可能会影响您的结果。

是的。建议尽可能使用干净的 dsDNA 制剂，但试剂盒可以耐受一些常见的污染物。每个试剂盒受各种污染物影响的方式各不相同。有关每个套件的更多信息，请参阅产品信息表。

AccuClear®、AccuBlue® 和 AccuGreen™ DNA 定量试剂盒使用高分子量 dsDNA 标准品，在定量高分子量 DNA 时最为准确。虽然所有 DNA 定量分析都在某种程度上对 DNA 长度敏感，但某些分析对短 dsDNA 片段的分析比其他分析更准确。

对于 25 到 500 bp 之间的片段定量：

• AccuBlue® 高灵敏度检测是最准确的；片段的荧光约为基因组 DNA 荧光的 80%，并且在长度和浓度上一致。

• AccuBlue® Broad Range assay is also consistent across length and concentration, with ~ 60% of the fluorescence of genomic DNA.

• AccuGreen™ High Sensitivity assay gives a consistent signal of ~ 80% of the fluorescence of genomic DNA with fragments of 100 bp and higher, but only in the range of 10-100 ng of DNA. Below that, small DNA fragments were inconsistently quantified.

• AccuClear® assay is more variable based on DNA fragment length and concentration. Therefore we do not recommend using this assay with short dsDNA fragments.

To quantify short dsDNA fragments we recommend:

• Use the AccuBlue® High Sensitivity DNA Quantitation assay

• Use sample concentrations well above the stated lower detection limit of the assay (for example, if the stated linear detection range is 0.2-100 ng, for a small fragment you should aim for an amount greater than 2 ng).

• （为获得最佳结果）提供您自己的 dsDNA 标准，其长度与您的样本相似。

可以针对 384 孔板缩小检测规模。按比例缩放所有试剂和 DNA 的体积。DNA、染料和增强剂（如果适用）的比例应与标准 96 孔协议中的相同。然而，在 96 孔板中使用少于 200 uL 的反应可能会导致较低的信号。

我们的任何 DNA 和 RNA 定量试剂盒都可以与 CLARIOstar 酶标仪一起使用，我们会定期在该型号上测试它们。例如，CLARIOstar 与具有最宽动态范围的 AccuClear® dsDNA 定量试剂盒以及具有最高灵敏度的 AccuBlue® NextGen dsDNA 定量试剂盒一起提供了出色的结果。

You can find information about our full selection of assays on the dsDNA Quantitation Technology page.

我们已经测试了各种不同的光源以在琼脂糖凝胶中形成 DNAzure® 条带。我们发现大多数光源都可以工作，但是开发需要多长时间取决于光线的亮度。使用我们的 Gel-Bright™ 和 Glo-Plate™ 蓝色 LED 照明器可以看到最快的条带发展。我们还看到了其他明亮的白色 LED 灯的良好效果。其他可以工作但需要更多时间的光源包括 LED 台灯和手机灯。我们发现 600W 的卤素灯效果不佳 - 它太热，会熔化凝胶。

为获得最佳染色效果，我们建议每次将 100X DNAzure® 原液稀释为 1X 新鲜工作溶液。但是，如果将 1X 溶液储存在 4°C 下并避光，则凝胶染色最多可保存两周。

是的，在特定条件下，1X DNAzure® 染色溶液可重复用于多种凝胶。重要的是，在凝胶暴露在光线下以形成条带之前，必须从凝胶中去除染色溶液。如果染色溶液经受光照射，它将无法染色另一块凝胶。用过的染色液在使用之间应存放在冰箱中，避光。我们已经成功地重新使用了储存长达 2 周的染色溶液，并且使用了多达 4 次，信号几乎没有丢失（使用 5 或 6 次后，灵敏度明显降低）。

我们建议将 DNAzure® 储存在 4°C。在室温下储存后，我们发现染料稳定性有所下降。

EvaGreen® 染料在光谱上与 FAM 或 SYBR® Green I 相似，这意味着使用基于 EvaGreen® 的预混液无需更改光学设置。但是，染料之间存在一些差异。

较低的背景荧光： EvaGreen® 染料由于其新颖的“按需释放”DNA 结合机制，比 SYBR® Green I 具有更少的背景。

更明亮且无抑制性：   EvaGreen® 在 PCR 反应中的抑制性低于 SYBR® Green，允许使用饱和染料浓度以获得最大信号和更好的高分辨率 DNA 熔解分析。

更安全、更环保：  EvaGreen® 染料是迄今为止第一种也是唯一一种对环境安全的 PCR 染料。

染料稳定性：  EvaGreen® 染料在储存期间和 PCR 条件下都非常稳定。另一方面，众所周知，SYBR® Green I 在多次冻融循环后和 PCR 条件下会降解。此外，据报道，分解的 SYBR® Green I 对 PCR 的抑制作用更大。

数字 PCR：  EvaGreen® 染料是目前唯一用于液滴数字 PCR (ddPCR) 的 qPCR 染料。

对于大多数 qPCR 应用，我们建议使用 EvaGreen® 染料，20X 水溶液 (31000)，或我们的一种 2X EvaGreen® qPCR 预混液。DMSO (31019) 中的 EvaGreen® 染料 2000X 适用于需要浓缩染料溶液的特殊应用。

如有必要，可将 DMSO 中的 EvaGreen® 染料 2000X 稀释于水或用于 qPCR 的预混液中，使 PCR 反应中的终浓度为 1X。

EvaGreen® 染料在光谱上与 FAM 或 SYBR® Green I 相似，这意味着与基于 SYBR® Green 的预混液相比，使用基于 EvaGreen® 的预混液无需更改光学设置。您可以在仪器的绿色荧光通道（FAM、SYBR® Green 或 EvaGreen®）中读取信号。

Biotium 提供三种不同的 EvaGreen® 染料基 qPCR 预混液：

• 勿忘我™ qPCR 预混液

• 快速 EvaGreen® qPCR 预混液

• Fast Plus EvaGreen® qPCR 预混液

所有三种预混液均包含我们的高品质 EvaGreen® DNA 结合染料和我们的快速活化化学修饰热启动酶 Cheetah™ Taq。

Forget-Me-Not™ qPCR 预混液是我们最新的预混液配方。对于大多数用途，这是我们推荐的预混液，因为它有很多好处：最佳灵敏度和信号、预混液和模板中的蓝色示踪染料可减少移液错误，并且成本低。Fast EvaGreen® qPCR 预混液是一种灵敏的通用预混液，不含蓝色示踪染料。Fast Plus EvaGreen® qPCR Master Mix 与常规 Fast EvaGreen® qPCR Master Mix 的配方略有不同，专为更具挑战性的样品而设计。

Forget-Me-Not™ EvaGreen® qPCR 预混液是一种热启动 EvaGreen® 染料预混液。它使用 Biotium 专有的化学修饰热启动 DNA 聚合酶 Cheetah™ Taq。该预混液还包含浅蓝色示踪染料，并附带深蓝色模板染料，用于双色示踪以减少移液错误。用户只需提供引物和模板。

Forget-Me-Not™ 通用探针预混液专为基于荧光探针的 PCR 应用而配制。它使用 Biotium 专有的化学修饰热启动 DNA 聚合酶 Cheetah™ Taq。除了引物和模板之外，用户还需要提供某种荧光探针（例如 TaqMan®、双标记 BHQ® 或 Molecular Beacon）。

这两种 qPCR 预混液都包含 Cheetah™ Taq（我们的化学修饰热启动 DNA 聚合酶）、缓冲液和 dNTP。

Fast EvaGreen® Master Mix 还含有 DNA 结合染料 EvaGreen®，用于基于荧光染料的 qPCR。用户唯一需要提供的是引物和模板。

Fast Probe Master Mix 专为使用基于寡核苷酸的探针（例如 TaqMan™ 探针、MGB 探针或 AllGlo™ 探针）进行实时 PCR 而配制。用户需要提供引物、探针和模板。

ROX 浓度为 35 nM，适用于低 ROX 仪器。如果您使用高 ROX 仪器，您可以在 TE 缓冲液（目录号 29052）中添加 25 mM ROX，该缓冲液可单独购买（目录号 29052）。

EvaGreen® 染料以 20X (25 uM) 的水（货号 31000）或 2000X（2.5 mM）的 DMSO（货号 31019 ）提供。

另请参阅我们用于 qPCR 的即用型EvaGreen® 预混液。

我们原创的 EvaGreen® 染料是一种饱和双链 DNA 结合染料，在定量实时 PCR (qPCR)、高分辨率熔解 (HRM)、数字微滴 PCR (ddPCR) 和其他基因组学应用方面优于 SYBR® Green I 和其他商用染料PCR染料。它提供了几个对 PCR 和相关应用至关重要的基本特性，包括高热稳定性、化学稳定性和光稳定性，由于与其新颖的“按需释放”机制相关的高信噪比而具有高灵敏度，对 PCR 没有抑制作用，并且不含染料移民。此外，EvaGreen® 染料无毒、无致突变性，对水生生物无害。

EvaGreen® Plus Dye 是原始 EvaGreen® 染料的高级版本，保留了相同的基本优点，同时提供更高的信噪比。这种更高的灵敏度为数字 PCR 和等温应用提供了更多优势。

EvaGreen® 染料用于 Biotium 的所有基于染料的qPCR 预混液，它结合了卓越的亮度和灵敏度，并能够在同一反应中进行熔解曲线分析。新的EvaGreen® Plus 染料可作为独立的 20X 水溶液提供。

我们的 qPCR 预混液都提供可选的 ROX 参考染料，一些 qPCR 仪器使用它来标准化 PCR 荧光。我们还包括使用无 ROX、低 ROX 或高 ROX 的说明，具体取决于您使用的仪器。根据仪器制造商的建议，我们建议如下：

无ROX

BioRad：iCycler™、MyiQ™、MiQ™2、iQ™5、CFX-96 Touch™、CFX-384 Touch™、Chromo4™、MiniOpticon™

Qiagen：Rotor-Gene® Q、Rotor-Gene® 3000、Rotor-Gene® 6000

Eppendorf：Mastercycler® Realplex

Illumina：Eco™ 实时 PCR 系统

造父变星：SmartCycler®

罗氏：LightCycler® 480、LightCycler® 2.0

低ROX

ABI：7500、7500 快速、ViiA 7™、QuantStudio™

Stratagene：MX4000P、MX3000P、MX3005P

高ROX

ABI：5700、7000、7300、7700、7900、7900HT、7900HT 快速、StepOne®、StepOne Plus®

当仪器读取荧光信号时，0.5X 至 1X EvaGreen® 通常用于 LAMP 应用。对于肉眼检测，可以使用增加浓度的 EvaGreen®。例如，Lee、SH等人。测试了高达 100X EvaGreen®，发现 10X EvaGreen® 最适合他们的检测。

EverBrite™ Mounting Medium (23001) 和 EverBrite™ Mounting Medium with DAPI (23002) 的折射率为 1.46。EverBrite™ Hardset Mounting Medium (23003) 和 EverBrite™ Hardset Mounting Medium with DAPI (23004) 的初始折射率均为 1.38，固化 24 小时后增至 1.42，4 天后增至 1.46，之后保持不变

是的，EverBrite™ 封片剂与多种染料兼容。与 VectaShield® 不同，EverBrite™ 不会干扰基于花青的荧光团，如 Alexa Fluor® 647、Cy®3 或 Cy®5。

AlexaFluor 是 Thermo Fisher Scientific 的注册商标；Cy Dye 是 Cytiva 的注册商标；VectaShield 是 Vector Laboratories 的注册商标。

EverBrite™ 湿式封片剂是一种含水的、含甘油的介质。它可以通过用 PBS 或其他缓冲液清洗几次从样品中去除。但是，用 PBS 洗涤不会去除 DAPI 染色。

对于使用 EverBrite™ Hardset 或 EverBrite™ 湿固介质固定在载玻片上的盖玻片，可将载玻片浸泡在载玻片罐中的 PBS 中数小时，同时轻轻搅拌，直到盖玻片滑落（避免撬动或拉动盖玻片，这可能会损坏例子）。然后多次清洗载玻片以去除任何残留的封固剂。如果盖玻片已用 CoverGrip™ 盖玻片密封剂密封，浸泡在 PBS 中也会去除密封剂。可能需要其他方法来去除其他类型的盖玻片密封剂。

CoverGrip™ 旨在替代指甲油以永久密封湿封盖玻片。它可以通过将载玻片浸泡在缓冲液中来去除。CoverGrip™ 并非设计用于为杂交创建可移动的临时密封件。

EverBrite™ 封固剂在紫色激发下确实显示出高背景荧光。当使用 UV 激发和 DAPI 滤光片立方体使用落射荧光成像时，背景更加突出，但在使用 405 nm 激光的共聚焦成像中通常非常低。

CellBrite® 细胞质膜染料不能有效地染色 EV，但 CellBrite® Fix、MemBrite® Fix、CellBrite® Steady 和其他染色剂已用于此应用。但是，为了对外泌体膜进行最佳染色，我们推荐使用我们的ExoBrite™ EV 膜染色剂。有关更多信息，请参阅我们的外泌体和 EV 标记技术页面。

对于任何想要对外泌体膜进行染色的人，我们的第一个建议是 ExoBrite™ EV 膜染色剂。ExoBrite™ EV 膜染色剂的优点是：

• 专为外泌体染色而设计和配制

• 非常低的背景，出色的信噪比

• 轻松与抗体结合进行共染（不像 CellBrite® Fix 或 MemBrite® Fix 等活性染料）

• 能够与珠结合的外泌体一起使用（与大多数其他膜或活性染料不同）

然而，我们发现其他一些膜和细胞表面染色剂也能够染色外泌体。其他染料均不具有与 ExoBrite™ EV 膜染料相同的低背景和高信噪比，但它们可能具有某些测定所需的其他特性（例如可固定性）。

用于通过流式细胞术检测 EV 的膜染料

显示第 1 到 4 个条目，共 4 个条目

1使用 qEV 大小排阻柱 (SEC) (IZON) 制备 SEC 纯化的 MCF-7 细胞来源的外泌体
2 Cell Host & Microbe (2018) Aug 8;24(2):208-220.e8 doi: 10.1016/j。 chom.2018.07.006
3 Cytometry A. (2016) Feb;89(2):196-206 doi: 10.1002/cyto.a.22787
4肛门。化学。(2021) 93, 14, 5897–5905 doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00253

是的，可以使用 ExoBrite™ EV 膜染色剂和荧光抗体同时对外泌体和 EV 进行染色。

对于纯化的外泌体，当外泌体在 1 mL 的 1X ExoBrite™ 加 1 ug 荧光抗体中染色时，我们已经看到了良好的结果。

对于珠子结合的外泌体，我们发现先用一抗染色，然后用 ExoBrite™ EV 膜染色，中间有一个洗涤步骤，可以得到最好的结果。当染色同时进行时，抗体信号不受影响，但 ExoBrite™ 信号减少约 25%。当珠子结合的外泌体在 100 uL 10X ExoBrite™ 加 1 ug 荧光抗体中染色时观察到这一点；使用不同比例的 ExoBrite™ 和抗体可能会产生不同的结果。

我们已经测试了我们所有的四跨膜蛋白（CD9、CD63 和 CD81）抗体克隆在流式细胞术中对通过体积排阻色谱 (SEC) 纯化的外泌体进行染色的能力。效果良好的克隆列在“外泌体和 EV 标记”技术页面的表格中。

我们已经测试了我们所有的四跨膜蛋白（CD9、CD63 和 CD81）和 Ep-CAM 抗体克隆在流式细胞术中对与 CD63 捕获磁珠结合的外泌体进行染色的能力。效果良好的克隆列在“外泌体和 EV 标记”技术页面的表格中。

https://biotium.com/technology/exosome-ev-labeling/#antibodies

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数日，因此产品很可能仍能正常工作。为了安全起见，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前，先进行小规模的阳性对照实验，以确认该产品仍然适用于您的应用。

我们知道的一个例外是 GelGreen™，它比我们大多数其他荧光染料对光照更敏感。如果 GelGreen™ 长时间（数天至数周）暴露在环境光下，其颜色将从深橙色变为砖红色。如果发生这种情况，GelGreen 将不再适用于凝胶染色。

GelRed® 和 GelGreen® 之间的主要区别在于它们的荧光激发和发射波长。GelRed® 具有红色荧光，类似于溴化乙锭。GelGreen® 具有绿色荧光，类似于 SYBR® Green 或 SYBR® Safe。两种染料都与标准的紫外透照仪兼容。GelGreen® 还与蓝光透照仪兼容，让用户避免将自己和他们的 DNA 样本暴露在紫外线辐射下。

GelRed® 和 GelGreen® 对双链核酸的灵敏度高于单链核酸，但 GelRed® 对单链核酸染色的灵敏度高于 GelGreen®。与单链核酸相比，GelRed® 对双链核酸的灵敏度大约是单链核酸的两倍，而对单链核酸染色的灵敏度是 GelGreen® 的大约五倍。

有关这些产品的更多信息，请访问我们的DNA 染色技术页面。

与 DMSO 中的原料相比，水配方是一种更新和改进的产品。我们建议在水中使用染料，以避免处理可通过皮肤吸收的 DMSO 的潜在危害。我们继续提供在 DMSO 中的染料，因为一些用户不希望改变他们既定的实验室协议。根据内部测试，两种配方的性能相似。

GelRed® 和 GelGreen® 可以在凝胶浇注过程中以 1X 的终浓度添加到琼脂糖中，或者它们可以以 3X 的终浓度在水中用于电泳后凝胶染色。如需详细的使用方案，请下载GelRed® 产品信息表或GelGreen® 产品信息表。

为方便起见，许多客户使用 GelRed® 或 GelGreen® 预制凝胶。然而，由于 GelRed® 和 GelGreen® 是高亲和力染料，设计为较大的染料以提高其安全性，因此它们会影响 DNA 在预制凝胶中的迁移。一些样品，例如限制性消化的 DNA，可能会在 GelRed® 或 GelGreen® 预制凝胶中异常迁移。

提示 #1：加载更少的 DNA

GelRed® 或 GelGreen® 预制凝胶中的污迹和微笑最常由 DNA 超载引起。如果您看到条带迁移发生变化或出现拖尾和微笑，请尝试减少加载的 DNA 量。已知浓度的 ladder 和样品的推荐上样量为 50-200 ng/泳道。对于未知浓度的样品，尝试加载通常量的一半或三分之一的 DNA。这通常可以解决带迁移问题。

提示 #2：尝试染色后方案

为避免染料可能对 DNA 迁移产生任何干扰，我们建议使用染色后方案。如果您的应用需要加载超过推荐量的 DNA，请使用染色后方案。虽然我们建议将凝胶染色后 30 分钟，但您可能会在短短五分钟内看到条带，具体取决于存在的 DNA 量。染色后溶液可以重复使用。有关详细方案，请参阅GelRed® 产品信息表或GelGreen® 产品信息表。

提高琼脂糖凝胶分辨率的其他技巧：

• 如果您在使用 GelRed® 或 GelGreen® 进行后染色后发现 DNA 迁移问题或拖尾，则问题不是由核酸染料引起的。避免过度填充凝胶孔，以防止 DNA 弄脏凝胶表面。

• 倒入较低百分比的琼脂糖凝胶。较高分子量的 DNA 使用较低百分比的凝胶分离效果更好。

• 更改运行缓冲区。TBE 缓冲液比 TAE 缓冲液具有更高的缓冲能力。

有几种可能：

1. 染料可能已从溶液中沉淀出来。

• 将 GelRed® 或 GelGreen® 溶液加热至 45-50°C 两分钟并涡旋溶解。

• 在室温下储存染料以避免沉淀。

2. 如果您看到凝胶的高背景染色，则您使用的琼脂糖可能质量不佳。琼脂糖中的污染物可能与染料结合，导致背景增加。

我们用 GelRed® 和 GelGreen® 测试了来自不同供应商的各种 DNA ladder，结果良好。同样，可以使用任何常见的 DNA 加载缓冲液。条带迁移问题或拖尾或微笑 DNA 条带最常见的原因是 ladder 过载。如果您的阶梯遇到谱带迁移问题，请尝试减少您加载的阶梯数量。对于 GelRed® 或 GelGreen® 预制凝胶，我们建议每条泳道加载 50-200 ng ladder。有关更多提示，请参阅有关涂抹或微笑 DNA 条带的常见问题解答。

Biotium 还提供TE 缓冲液中的1 kb 和 100 bp DNA 分子量标准或加载缓冲液中的即用型。梯子配有单独的 6X DNA 上样缓冲液管，可用于您的样品。

GelRed® 和 GelGreen® 是稳定的染料。您可以在室内光线下使用染料。但是，我们建议在两次使用之间将染料储存在黑暗中。我们收到一份客户报告，称在不小心将 GelRed® 置于环境光下一个月后，该产品成功使用。

GelRed® 和 GelGreen® 可用于染色 ssDNA 和 RNA，但 GelRed® 对单链核酸的灵敏度比 GelGreen® 高 5 倍左右。使用荧光酶标仪的滴定分析表明，与 ssDNA 和 RNA 结合的 GelRed® 的荧光信号大约是与 dsDNA 结合的 GelRed® 的荧光信号的一半。

我们和其他用户经常观察到 GelGreen® 将 ssDNA 和 RNA 染成橙色/粉红色，将 dsDNA 染成绿色。我们还看到较小的 dsDNA 片段可以呈现橙粉色，颜色范围为白-粉-橙色。我们不确定潜在的机制，可能是单链核酸的结构有利于改变 GelGreen® 单体的堆叠相互作用，从而导致形成具有红色发射的 J 聚集体。

是的，客户已报告在乙二醛和甲醛琼脂糖凝胶中使用 GelRed® 对 RNA 进行预制染色。

是的

是的，使用聚丙烯酰胺凝胶的后染色方案。对于丙烯酰胺含量为 3.5-10% 的聚丙烯酰胺凝胶，典型的染色时间为 30 分钟至 1 小时，丙烯酰胺含量较高的凝胶需要较长的染色时间。

Biotium 还提供PAGE GelRed® 一种无毒、无诱变性染料，专门设计用于在聚丙烯酰胺凝胶中染色 DNA。

是的。请使用 DGGE 和 EMSA 凝胶的染色后程序。对于 PFGE 凝胶，可以使用预制或染色后方案。

是的，GelRed® 与碱性电泳缓冲液兼容。

Yes, GelRed® and GelGreen® can be used for Comet assay.

是的，参见Virol J. 2012, 9, 110。

是的，参见电泳，doi：10.1002/elps.201200624  。

客户报告在铯梯度中使用 GelRed®。要在铯显带后从 DNA 中提取 GelRed®，我们建议在丁醇提取前添加 SDS 至终浓度为 0.1%。或者，可以使用氯仿代替丁醇进行提取。

GelRed® 和 GelGreen® 是超敏感染料。一些用户报告说能够检测到含有少于 0.1 ng DNA 的条带。然而，染色的灵敏度将取决于仪器的能力和曝光设置。

GelRed® 已被证明仅通过嵌入结合 DNA ( https://link.springer.com/article/10.1007/s00249-014-0995-4 )。GelGreen® 最有可能通过嵌入和静电相互作用的组合结合。

GelRed® 和 GelGreen® 不像溴化乙锭那样容易通过凝胶迁移。无需向电泳缓冲液中添加额外的染料，凝胶比用溴化乙锭染色的凝胶染色更均匀。

是的。我们推荐使用 Qiagen 或 Zymoclean™ 凝胶提取试剂盒或苯酚-氯仿提取来去除 DNA 中的染料。一些用户报告说，在没有纯化步骤的情况下，在 GelRed® 存在的情况下对 DNA 进行 PCR，例如通过在 TE 缓冲液中孵育 GelRed® 染色的凝胶切片，通过被动扩散提取 DNA 用于 PCR，或使用几微升的来自 GelRed® 染色凝胶切片的熔融琼脂糖，其中含有用于 PCR 的 DNA。

客户使用 Zymo Research 的 ZymoClean™ 凝胶 DNA 回收试剂盒、Sigma 的 GenElute™ 琼脂糖离心柱、Life Technologies 的 PureLink® 快速凝胶提取试剂盒、GE Healthcare 的 illustra GFX PCR DNA 和凝胶条带纯化试剂盒、高纯 PCR 产品报告了良好的结果Roche Applied Sciences 的纯化试剂盒和 Thermo Scientific 的 GenJET 凝胶提取试剂盒。

GelRed® 已通过 Southern 印迹验证。我们建议使用染色后方案进行印迹应用。

GelRed® 和 GelGreen® 可以在凝胶浇注过程中以 1X 的终浓度添加到琼脂糖中，或以 3X 的终浓度在水中用于电泳后凝胶染色。将 10,000X 库存稀释 10,000 倍用于 1X 预制凝胶（例如，5 uL 用于 50 mL 凝胶），或 3,333 倍用于 3X 后染色溶液（15 uL 用于 50 mL 溶液）。

一个 0.5 mL 的 GelRed® 或 GelGreen® 小瓶可用于使用预制方案制备 100 块迷你凝胶（每块 50 mL），或用于在每块凝胶 50 mL 染色溶液中对 33 块迷你凝胶进行电泳后染色。染色后溶液也可重复用于对两种或多种凝胶进行染色。如需详细的使用方案，请下载GelRed® 产品信息表或GelGreen® 产品信息表。

否，但如果背景高，可以用水脱色。

是的。但是，如果灵敏度降低，请使用新鲜的染料溶液。

我们不建议将 GelRed® 或 GelGreen® 直接添加到上样缓冲液中，因为这会导致条带迁移不准确。Biotium 提供专为该应用设计的6X GelRed® Prestain 上样缓冲液，但我们不推荐将它们用于需要精确确定 DNA 条带大小的应用。为了最准确地确定 DNA 条带大小，我们建议使用 GelRed® 后染色（有关详细信息，请参见GelRed® 方案）。

GelRed® 与标准紫外线透照仪（302 或 312 nm）兼容。
GelGreen® 在 250-300 nm 之间有足够的吸收，在 500 nm 左右有一个强吸收峰。GelGreen® 与 254 nm 紫外透照仪或具有可见光激发的凝胶读取器（例如 Dark Reader 或 488 nm 激光凝胶扫描仪）兼容。

使用 GelRed® 的溴化乙锭过滤器；GelGreen® 使用 SYBR® Green 或黄色过滤器。或者，长通黄色滤光片可与 GelRed® 和 GelGreen® 一起使用。请查看 GelRed® 和 GelGreen® 的发射光谱以获得更具体的波长。

预制 GelRed® 凝胶最多可存放一周，GelGreen® 凝胶最多可存放一个月。我们建议将凝胶在室温下避光保存。我们不再建议在 4°C 下储存凝胶，因为这会导致染料沉淀和性能下降。

不可以。我们不建议 GelRed®/GelGreen® 凝胶在电泳后重复使用，因为顺序电泳会降低染色强度。

是的，未使用的凝固琼脂糖与 GelRed® 或 GelGreen® 可以重新熔化。如果未使用的带有染料的琼脂糖要储存超过一天左右，我们建议将其避光。

GelRed® 比 GelGreen® 更稳定。我们不建议将 GelRed® 在熔化的琼脂糖中储存超过几天。

在 AMES 和相关测试中，GelRed® 和 GelGreen® 被证明是 EtBr 和 SYBR 染料更安全的替代品。尽管如此，在使用这些试剂时请遵循安全的实验室规范。

请访问我们的网站 www.biotium.com.cn 下载综合安全报告。

根据加州法规第 22 条，GelRed® 和 GelGreen® 被归类为无害的下水道处理。一些设施已批准将 GelRed® 和 GelGreen® 直接倒入下水道。但是，由于法规各不相同，请联系您的安全办公室以获取当地的处置指南。请查看GelRed®/GelGreen® 安全报告以获取更多详细信息。

为方便起见，许多客户使用 GelRed® 或 GelGreen® 预制凝胶。然而，由于 GelRed® 和 GelGreen® 是高亲和力染料，设计为较大的染料以提高其安全性，因此它们会影响 DNA 在预制凝胶中的迁移。一些样品，例如限制性消化的 DNA，可能会在 GelRed® 或 GelGreen® 预制凝胶中异常迁移。

提示 #1：加载更少的 DNA

GelRed® 或 GelGreen® 预制凝胶中的污迹和微笑最常由 DNA 超载引起。如果您看到条带迁移发生变化或出现拖尾和微笑，请尝试减少加载的 DNA 量。已知浓度的 ladder 和样品的推荐上样量为 50-200 ng/泳道。对于未知浓度的样品，尝试加载通常量的一半或三分之一的 DNA。这通常可以解决带迁移问题。

提示 #2：尝试染色后方案

为避免染料可能对 DNA 迁移产生任何干扰，我们建议使用染色后方案。如果您的应用需要加载超过推荐量的 DNA，请使用染色后方案。虽然我们建议将凝胶染色后 30 分钟，但您可能会在短短五分钟内看到条带，具体取决于存在的 DNA 量。染色后溶液可以重复使用。有关详细方案，请参阅GelRed® 产品信息表或GelGreen® 产品信息表。

提高琼脂糖凝胶分辨率的其他技巧：

• 如果您在使用 GelRed® 或 GelGreen® 进行后染色后发现 DNA 迁移问题或拖尾，则问题不是由核酸染料引起的。避免过度填充凝胶孔，以防止 DNA 弄脏凝胶表面。

• 倒入较低百分比的琼脂糖凝胶。较高分子量的 DNA 使用较低百分比的凝胶分离效果更好。

• 更改运行缓冲区。TBE 缓冲液比 TAE 缓冲液具有更高的缓冲能力。

有几种可能：

1. 染料可能已从溶液中沉淀出来。

• 将 GelRed® 或 GelGreen® 溶液加热至 45-50°C 两分钟并涡旋溶解。

• 在室温下储存染料以避免沉淀。

2. 如果您看到凝胶的高背景染色，则您使用的琼脂糖可能质量不佳。琼脂糖中的污染物可能与染料结合，导致背景增加。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数日，因此产品很可能仍能正常工作。为了安全起见，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前，先进行小规模的阳性对照实验，以确认该产品仍然适用于您的应用。

我们知道的一个例外是 GelGreen™，它比我们大多数其他荧光染料对光照更敏感。如果 GelGreen™ 长时间（数天至数周）暴露在环境光下，其颜色将从深橙色变为砖红色。如果发生这种情况，GelGreen 将不再适用于凝胶染色。

Biotium 的一些荧光素酶检测试剂盒可用作 Promega 试剂盒的替代品。可比较的产品如下所列。单击产品信息的链接。

生物科学试剂盒
产品信息表上列出了自收到生物科学试剂盒之日起保证的保质期。一些套件在套件盒标签上印有有效期，这是从产品从我们工厂发货之日算起的保证保质期。套件的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧试剂盒，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该试剂盒仍适用于您的应用。

抗体和其他偶联物
产品信息表上列出了抗体和偶联物自收货之日起的保证保质期。抗体和其他结合物的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧偶联物，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该产品仍适用于您的应用。

对于冻干抗体，我们建议用甘油和抗菌防腐剂（如叠氮化钠）重构抗体以获得最长的保质期（请注意，叠氮化钠与 HRP 偶联物不相容）。

化学品、染料和凝胶染色剂
Biotium 保证化学品、染料和凝胶染色剂在您收到产品之日起至少一年内保持稳定。然而，只要按照建议储存，这些产品中的大多数在多年内都非常稳定。存储条件可在产品信息表或产品安全和数据表、材料安全数据表以及产品标签上找到。荧光化合物应避光以便长期储存。

如果您希望使用已储存超过一年的 Biotium 化合物，我们建议您进行小规模阳性对照实验，以确认该化合物在处理大量样品或珍贵样品之前仍适用于您的应用样品。

基于生产日期的有效期 (DOM)
如果您的机构要求您记录基于试剂生产日期的有效期，请联系 techsupport@biotium.com 寻求帮助。

有特殊稳定性考虑的化工产品：

酯类

酯类化合物包括：
• 琥珀酰亚胺酯（SE，也称为 NHS 酯），例如我们的胺反应性染料
• 乙酰氧基甲基酯（AM 酯），例如我们的膜渗透性离子指示剂染料
• 二乙酸酯改性染料，例如 ViaFluor ™ 405、CFDA 和 CFDA-SE 细胞活力/细胞增殖染料

只要避光和防潮，酯类染料在固体形式下是稳定的。酯在水溶液中不稳定。应在无水 DMSO中制备浓缩储备液（参见 Biotium 目录号90082）。无水 DMSO 中的储备液可在 -20°C 下干燥保存一个月或更长时间。酯类应在使用前立即用水溶液稀释。琥珀酰亚胺酯 (SE) 应溶解在不含会与 SE 官能团反应的含胺化合物（如 Tris、甘氨酸或蛋白质）的溶液中。AM 酯和二乙酸化合物应溶解在不含血清的溶液中，因为血清可能含有会水解该化合物的酯酶。

关于 CF® 染料琥珀酰亚胺酯稳定性的说明

琥珀酰亚胺酯 (SE) 通常容易水解，从而导致标记效率降低。许多用于生命科学研究的市售荧光染料都是高度磺化的染料，这使得它们特别容易吸湿，从而加剧了水解问题。此外，对于几种市售的 SE 活性染料，SE 基团衍生自芳香族羧酸，而 Biotium 的所有 CF® 染料中的 SE 基团均由脂肪族羧酸制备。这种结构差异降低了 CF® Dye SE 反应基团对水解的敏感性，从而产生相对稳定的活性染料，与其他荧光染料的其他 SE 衍生物相比，标记效率始终更高。

马来酰亚胺、MTS 和硫代硫酸盐染料
与琥珀酰亚胺酯染料一样，这些染料也容易水解，尽管水解程度通常要低得多。因此，对于长期储存，建议使用无水 DMSO 制备储备溶液。

其他活性染料
胺类、氨氧基（也称为甲醛）、酰肼、叠氮化物、炔烃、BCN 和酪胺类活性染料，以及染料游离酸，在-20°C 下储存 6-12 年时通常在水溶液中稳定几个月或更长时间，只要不存在可能与染料的官能团发生反应的化合物。有关特定活性染料的更多信息，请参阅产品信息表。

腔肠素和 D-荧光素

按照建议储存时，腔肠素以固体形式稳定；它们在水溶液中不稳定。应在乙醇或甲醇中制备浓缩腔肠素储备液（通常为 1-100 mg/mL）；不要使用 DMSO 或 DMF 溶解腔肠素，因为这些溶剂会氧化化合物。腔肠素的乙醇或甲醇库存可在 -20°C 或以下储存六个月或更长时间；酒精储备在储存过程中可能会蒸发，因此请使用密封的螺旋盖小瓶并用封口膜包裹小瓶以进行长期储存。丙二醇也可用作溶剂以减少蒸发。如果溶剂蒸发，腔肠素仍会存在于小瓶中，因此在储存前记下小瓶中的体积，以便您可以根据需要调整溶剂体积以校正蒸发。使用前立即在水性缓冲液中制备工作溶液。腔肠素在水溶液中最多可稳定 5 小时。

Aquaphile™ 腔肠素是腔肠素的水溶性制剂。当按照建议储存时，它们以固体形式稳定。Aquaphile™ 腔肠素应在使用前立即溶解在水溶液中。它们在水溶液中最多可稳定 5 小时。

请注意，腔肠素主要是黄色固体，但可能含有深红色或棕色斑点。这不会影响产品稳定性或性能。如果您的腔肠素呈均匀的棕色，则说明它已被氧化，需要更换。

D-荧光素在固体形式下是稳定的，并且在按照建议储存时作为浓缩储备液；它在水溶液中的稀释工作浓度下不稳定。在水中制备浓缩的 D-荧光素储备溶液（通常为 1-100 mg/mL），并在 -20°C 或更低温度下分装储存六个月或更长时间。使用前立即准备工作解决方案。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数天，但我们建议在 4°C 或 -20°C 下储存以延长保质期。对于我们的许多染料水溶液，这些化合物在室温下非常稳定，但我们建议冷藏以防止霉菌或其他微生物随着时间的推移而生长。因此，为节省运输成本，建议在 4°C 或 -20°C 下储存的产品可以在环境温度下或使用冰袋运输。这些产品可能会解冻而不影响产品性能。当您收到产品时，请将其置于推荐的存储条件下。

一些产品随附蓝色冰袋作为额外的高温预防措施。蓝色冰袋可在到达时解冻，而不会影响产品性能。

否。缓冲液基于不同的专有配方。

Passive Lysis Buffer (Renilla) 与 Firefly Assay 兼容，但 Firefly Lysis Buffer 与 Renilla Assay 不兼容。

是的，请查看网站上的目录号

不是。Biotium 的海肾和萤火虫检测试剂盒基于闪光发光。样品应单独处理和读取。或者，您可以购买用于 HTS 的 Steady-Glo 萤火虫检测试剂盒。我们目前没有用于 Renilla 检测的 Steady-Glo。

海肾通常用作转染效率的内部对照，而萤火虫荧光素酶载体用于报告基因活性。它们也可以颠倒过来，将 Renilla 作为报告基因，将 Firefly 作为内部对照。

我们尚未对 One-Glo™ 和 Steady-Luc™ 检测进行并排比较，但根据 Promega 网站上 One-Glo 和 Steady-Glo 的比较，我们预计来自 Steady-Luc 的信号™ 测定类似于 Steady-Glo™。

我们的 Steady-Luc™ 试剂是一种均质荧光素酶检测试剂，可以像 One-Glo™ 试剂一样直接添加到培养基中，Steady-Luc™ 工作溶液在室温下至少可稳定 18 小时。

不，我们新的Firefly & Renilla 单管检测试剂盒允许您在单个裂解液样品中顺序测量萤火虫和 Renilla 荧光素酶活性。

检测灵敏度取决于许多因素，包括每个载体的启动子强度、每个载体的转染效率和使用的细胞类型。总的来说，萤火虫荧光素酶的应用更为广泛，因为它比海肾荧光素酶具有更长的半衰期和更好的稳定性。

Biotium 的 Renilla 和 Firefly 检测是闪光发光检测。雷尼拉的半衰期约为 1-2 分钟，萤火虫的半衰期约为 10 分钟。Steady-Glo Firefly Assay 的半衰期约为 3-5 小时。然而，该信号约为闪光发光检测的 1/10。

发光值是相对的，取决于实验系统。例如，来自两个不同制造商的光度计可能每个都具有 6-log 能力，但一个可以测量 1 到 1,000,000 相对光单位 (RLU) 的范围，而另一个测量 0.01 到 10,000 RLU。两种仪器都可以测量 6 个对数单位的动态范围，但它们读出的任意单位不同。

ATP-Glo™ 试剂盒中提供的萤火虫荧光素酶是重组的，在大肠杆菌中产生。

腔肠素主要是黄色固体，但可能含有深红色或棕色斑点。这不会影响产品稳定性或性能。如果您的腔肠素呈均匀的棕色，则说明它已被氧化，需要更换。

迄今为止，我们还没有发现一种荧光细胞染色剂可以检测细菌而不是具有高特异性的哺乳动物细胞，反之亦然。虽然一些哺乳动物细胞染色剂对细菌的染色较弱，但它们通常会显示一些信号，并且死细菌的染色通常比活细菌更强烈。

我们提供针对特定细菌抗原的一系列抗体，这些抗体可能用于细菌与哺乳动物细胞的差异染色，但我们尚未在共培养模型中验证它们。

另请参阅我们的Viability PCR 技术页面，了解 PMA 染料如何用于复杂样品中微生物细胞活力的高度特异性检测。

在使用细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（目录号30027）染色后不建议固定，因为死细胞染料 EthD-III 会转移到所有细胞并且不会维持死细胞特异性染色。我们的 Live-or-Dye™ NucFix™ Red（目录号32010）是一种可用于细菌的甲醛固定死细胞染料。

Viability qPCR (vPCR) 可以作为定量活细菌和死细菌的替代策略。使用死细胞特异性染料 PMA（目录号40019）或 PMAxx（目录号40069）在光交联后共价修饰 DNA（仅死细胞），使用简单的定量 PCR (qPCR) 扩增选择性扩增活细胞DNA。了解有关 vPCR技术的更多信息。

CellBrite® and MemBrite® Stains were originally developed for staining mammalian cells in culture, but some of the stains also have been validated for other organisms and applications. For dyes to stain yeast or bacteria membranes, see Cellular Stains in Different Organisms.

CellBrite®细胞质膜染料不染色细菌。活性CellBrite® Fix 染料可染色革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，而MemBrite® Fix染料仅染色革兰氏阳性细菌。然而，我们还没有测试这些染料在细菌中的细胞分裂追踪。

有文献描述了使用 CFSE 追踪细菌细胞分裂，ViaFluor® SE细胞增殖染料可能以类似的方式起作用，但我们尚未对此进行测试。

请参阅我们的细胞染色剂表， 了解完整的细胞染色剂列表及其对各种细胞类型的染色能力。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数日，因此产品很可能仍能正常工作。为了安全起见，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前，先进行小规模的阳性对照实验，以确认该产品仍然适用于您的应用。

我们知道的一个例外是 GelGreen™，它比我们大多数其他荧光染料对光照更敏感。如果 GelGreen™ 长时间（数天至数周）暴露在环境光下，其颜色将从深橙色变为砖红色。如果发生这种情况，GelGreen 将不再适用于凝胶染色。

生物科学试剂盒
产品信息表上列出了自收到生物科学试剂盒之日起保证的保质期。一些套件在套件盒标签上印有有效期，这是从产品从我们工厂发货之日算起的保证保质期。套件的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧试剂盒，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该试剂盒仍适用于您的应用。

抗体和其他偶联物
产品信息表上列出了抗体和偶联物自收货之日起的保证保质期。抗体和其他结合物的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧偶联物，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该产品仍适用于您的应用。

对于冻干抗体，我们建议用甘油和抗菌防腐剂（如叠氮化钠）重构抗体以获得最长的保质期（请注意，叠氮化钠与 HRP 偶联物不相容）。

化学品、染料和凝胶染色剂
Biotium 保证化学品、染料和凝胶染色剂在您收到产品之日起至少一年内保持稳定。然而，只要按照建议储存，这些产品中的大多数在多年内都非常稳定。存储条件可在产品信息表或产品安全和数据表、材料安全数据表以及产品标签上找到。荧光化合物应避光以便长期储存。

如果您希望使用已储存超过一年的 Biotium 化合物，我们建议您进行小规模阳性对照实验，以确认该化合物在处理大量样品或珍贵样品之前仍适用于您的应用样品。

基于生产日期的有效期 (DOM)
如果您的机构要求您记录基于试剂生产日期的有效期，请联系 techsupport@biotium.com 寻求帮助。

有特殊稳定性考虑的化工产品：

酯类

酯类化合物包括：
• 琥珀酰亚胺酯（SE，也称为 NHS 酯），例如我们的胺反应性染料
• 乙酰氧基甲基酯（AM 酯），例如我们的膜渗透性离子指示剂染料
• 二乙酸酯改性染料，例如 ViaFluor ™ 405、CFDA 和 CFDA-SE 细胞活力/细胞增殖染料

只要避光和防潮，酯类染料在固体形式下是稳定的。酯在水溶液中不稳定。应在无水 DMSO中制备浓缩储备液（参见 Biotium 目录号90082）。无水 DMSO 中的储备液可在 -20°C 下干燥保存一个月或更长时间。酯类应在使用前立即用水溶液稀释。琥珀酰亚胺酯 (SE) 应溶解在不含会与 SE 官能团反应的含胺化合物（如 Tris、甘氨酸或蛋白质）的溶液中。AM 酯和二乙酸化合物应溶解在不含血清的溶液中，因为血清可能含有会水解该化合物的酯酶。

关于 CF® 染料琥珀酰亚胺酯稳定性的说明

琥珀酰亚胺酯 (SE) 通常容易水解，从而导致标记效率降低。许多用于生命科学研究的市售荧光染料都是高度磺化的染料，这使得它们特别容易吸湿，从而加剧了水解问题。此外，对于几种市售的 SE 活性染料，SE 基团衍生自芳香族羧酸，而 Biotium 的所有 CF® 染料中的 SE 基团均由脂肪族羧酸制备。这种结构差异降低了 CF® Dye SE 反应基团对水解的敏感性，从而产生相对稳定的活性染料，与其他荧光染料的其他 SE 衍生物相比，标记效率始终更高。

马来酰亚胺、MTS 和硫代硫酸盐染料
与琥珀酰亚胺酯染料一样，这些染料也容易水解，尽管水解程度通常要低得多。因此，对于长期储存，建议使用无水 DMSO 制备储备溶液。

其他活性染料
胺类、氨氧基（也称为甲醛）、酰肼、叠氮化物、炔烃、BCN 和酪胺类活性染料，以及染料游离酸，在-20°C 下储存 6-12 年时通常在水溶液中稳定几个月或更长时间，只要不存在可能与染料的官能团发生反应的化合物。有关特定活性染料的更多信息，请参阅产品信息表。

腔肠素和 D-荧光素

按照建议储存时，腔肠素以固体形式稳定；它们在水溶液中不稳定。应在乙醇或甲醇中制备浓缩腔肠素储备液（通常为 1-100 mg/mL）；不要使用 DMSO 或 DMF 溶解腔肠素，因为这些溶剂会氧化化合物。腔肠素的乙醇或甲醇库存可在 -20°C 或以下储存六个月或更长时间；酒精储备在储存过程中可能会蒸发，因此请使用密封的螺旋盖小瓶并用封口膜包裹小瓶以进行长期储存。丙二醇也可用作溶剂以减少蒸发。如果溶剂蒸发，腔肠素仍会存在于小瓶中，因此在储存前记下小瓶中的体积，以便您可以根据需要调整溶剂体积以校正蒸发。使用前立即在水性缓冲液中制备工作溶液。腔肠素在水溶液中最多可稳定 5 小时。

Aquaphile™ 腔肠素是腔肠素的水溶性制剂。当按照建议储存时，它们以固体形式稳定。Aquaphile™ 腔肠素应在使用前立即溶解在水溶液中。它们在水溶液中最多可稳定 5 小时。

请注意，腔肠素主要是黄色固体，但可能含有深红色或棕色斑点。这不会影响产品稳定性或性能。如果您的腔肠素呈均匀的棕色，则说明它已被氧化，需要更换。

D-荧光素在固体形式下是稳定的，并且在按照建议储存时作为浓缩储备液；它在水溶液中的稀释工作浓度下不稳定。在水中制备浓缩的 D-荧光素储备溶液（通常为 1-100 mg/mL），并在 -20°C 或更低温度下分装储存六个月或更长时间。使用前立即准备工作解决方案。

请参阅我们的CF® 染料快速参考表，了解染料列表及其特性摘要。我们的CF® 染料选择指南包含有关每种 CF® 染料的更多详细信息，以及我们各种 CF® 染料产品线的订购信息。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数天，但我们建议在 4°C 或 -20°C 下储存以延长保质期。对于我们的许多染料水溶液，这些化合物在室温下非常稳定，但我们建议冷藏以防止霉菌或其他微生物随着时间的推移而生长。因此，为节省运输成本，建议在 4°C 或 -20°C 下储存的产品可以在环境温度下或使用冰袋运输。这些产品可能会解冻而不影响产品性能。当您收到产品时，请将其置于推荐的存储条件下。

一些产品随附蓝色冰袋作为额外的高温预防措施。蓝色冰袋可在到达时解冻，而不会影响产品性能。

对于 CF® 染料、花青染料、FITC、生物素、DNP 和 dig 试剂盒，请参见下面的 Mix-n-Stain™ 试剂盒兼容性和方案选择流程图。我们还建议下载更新的产品协议并完成预标记清单，以找到适用于您希望标记的每种抗体的正确协议和试剂盒大小。在我们的CF® 染料技术页面上了解有关 CF® 染料的更多信息，或下载CF® 染料手册。

请注意，Mix-n-Stain™ Maxi 1 mg Scale Kits、Mix-n-Stain™ 荧光蛋白标记试剂盒（R-PE、APC、PerCP 或串联染料）、Mix-n-Stain™ 酶标记试剂盒（AP、 HRP、GOx) 具有不同的兼容性要求和标签协议。检查您的试剂盒的协议以验证您的抗体与标记相容，然后选择与您希望标记的抗体量相匹配的试剂盒大小。

Mix-n-Stain™ CF® 染料抗体标记试剂盒兼容性和方案选择流程图。

CF® 染料是高度水溶性的小型有机染料，由 Biotium 的科学家设计，用于标记蛋白质和核酸。我们的 CF® 染料有超过 35 种颜色（并且还在增加），其中许多颜色比竞争染料更亮、更耐光。有关更多信息，请参阅各个 CF® 染料的产品传单、CF® 染料选择指南和我们的 CF® 染料常见问题解答。

PBS、HEPES、MES、MOPS 或硼酸盐缓冲液兼容。最多包含 20 mM Tris 的缓冲液也是兼容的。应使用试剂盒中提供的超滤瓶去除浓度高于 20 mM 的 Tris。有关详细信息，请参阅产品协议。

虽然在没有稳定蛋白的情况下标记抗体通常可以获得最佳结果，但可以使用 Mix-n-Stain™ CF® 染料抗体标记试剂盒标记带有 BSA 或明胶的抗体。BSA 或明胶也会被标记，但由于 CF® 染料的高溶解性，标记的 BSA 或明胶在标准免疫荧光染色过程中会被洗掉。我们建议下载更新的产品协议并完成预标记清单，以找到适用于您希望标记的每种抗体的正确协议和试剂盒大小。另请参阅下面的 Mix-n-Stain™ 套件兼容性和协议选择流程图。

请注意，Mix-n-Stain™ Maxi 1 mg Scale Kits、Mix-n-Stain™ 荧光蛋白标记试剂盒（R-PE、APC、PerCP 或串联染料）、Mix-n-Stain™ 酶标记试剂盒（AP、 HRP、GOx) 具有不同的兼容性要求和标签协议。检查您的试剂盒的协议以验证您的抗体与标记相容，然后选择与您希望标记的抗体量相匹配的试剂盒大小。

腹水中的 IgG 可以使用Mix-n-Stain™ CF® 染料抗体标记试剂盒进行标记，使用更大尺寸的试剂盒和我们改进的 Mix-n-Stain™ 方案可获得良好的结果。下载更新的产品协议并完成预标记清单以选择合适的套件大小和标记协议。

Mix-n-Stain™ Maxi 1 mg Scale 试剂盒、Mix-n-Stain™ 荧光蛋白标记试剂盒（R-PE、APC、PerCP 或串联染料）、Mix-n-Stain™ 酶标记试剂盒（AP、HRP、 GOx) 有不同的兼容性要求和标记协议，不能用于标记腹水中的抗体。检查您的试剂盒的协议以验证您的抗体与标记相容，然后选择与您希望标记的抗体量相匹配的试剂盒大小。

Mix-n-Stain™ 标记不适用于血清或杂交瘤细胞培养上清液中的抗体。我们建议在标记前从血清或上清液中纯化 IgG。

对于 CF® 染料、花青染料、FITC、生物素、DNP 和 dig Mix-n-Stain™ 试剂盒，叠氮化钠、EDTA、小糖和 <10% 的甘油对标记没有影响。应使用试剂盒中提供的超滤瓶去除更高水平的甘油或任何水平的 DTT、2-巯基乙醇或游离氨基酸（如甘氨酸）。有关详细信息，请参阅产品协议。

请注意，Mix-n-Stain™ Maxi 1 mg Scale Kits、Mix-n-Stain™ 荧光蛋白标记试剂盒（R-PE、APC、PerCP 或串联染料）、Mix-n-Stain™ 酶标记试剂盒（AP、 HRP、GOx) 具有不同的兼容性要求和标签协议。检查您的试剂盒的协议以验证您的抗体与标记相容，然后选择与您希望标记的抗体量相匹配的试剂盒大小。

Mix-n-Stain™ 标记导致染料和抗体共价连接，因此不会有染料扩散或转移。

直接免疫荧光染色无需二抗孵育和洗涤步骤，并允许使用来自同一物种的多种一抗进行多色检测，或使用同一物种产生的抗体对动物组织进行染色，而无二抗交叉反应（例如小鼠对小鼠染色）。

1. 与 Zenon 不同，Mix-n-Stain™ 标记将染料共价连接到抗体上，从而消除了多色染色过程中抗体之间的染料转移或扩散。

2. Mix-n-Stain™ 偶联物在储存缓冲液中至少可稳定 6 个月，而 Zenon 复合物必须在 30 分钟内使用。

3. Mix-n-Stain™ 偶联物体积较小，因为染料直接与抗体相连，这与使用抗体片段的 Zenon 偶联物不同。

4. Mix-n-Stain™ 不需要染色后固定。

5. 与 Zenon 不同，Mix-n-Stain 标记不是物种特异性的。

Mix-n-Stain™ 抗体标记试剂盒的主要优势在于它们包含我们的新型 CF® 染料，这些染料比 Lightning Link® 试剂盒中提供的染料更亮、更耐光。Mix-n-Stain™ 试剂盒的尺寸适合标记少量抗体，并作为单一标记出售，与 Lightning Link® 试剂盒相比提供更大的灵活性。

Lightning Link 是 Expedeon 的注册商标。

染料共价连接到远离抗原结合位点的氨基酸侧链，因此抗体的亲和力不受影响。然而，确切的附着位点和化学键的性质是专有信息。

Mix-n-Stain™ 试剂盒不会专门标记抗体的 Fc 区，它们会标记可接近的反应性残基，而不管抗体上的位置如何。抗体 Fc 区标记染料的图像仅供参考。我们设计的 Mix-n-Stain™ 标记试剂盒可为每种染料提供最佳 DOL，从而最大限度地减少对抗体结合亲和力的影响。基于此，很可能大部分标记位于抗体的 Fc 区，该区不直接结合抗原。在某些情况下，抗体标记会破坏抗体-抗原结合，通常是单克隆抗体，但根据我们的经验，这种情况很少见。

Mix-n-Stain™ 试剂盒的标记程度估计在每个抗体 4-6 个染料分子的范围内。

这个问题涉及我们发明的一个关键要素。我们染料和缓冲液的独特配方以及标记策略完全消除了这一问题，而这通常是使用传统抗体标记方法时必须处理的问题。关于如何解决这个问题的确切机制是专有信息。对于活细胞，我们建议使用提供的超滤瓶或在 4°C 下染色进行快速纯化，以防止游离染料可能被内吞。

只要要标记的抗体量在每个试剂盒指定的范围内，就无需测量染料量或改变反应时间。由于专有染料和反应缓冲液，Mix-n-Stain™ 标记试剂盒可确保最佳标记。

该试剂盒针对标记浓度在 0.5-1.0 mg/mL 之间的抗体进行了优化。如果您的抗体溶液太稀，您可以使用试剂盒中提供的超滤瓶通过离心将其浓缩。如果您的抗体溶液太浓，您可以用 1x PBS 稀释。超出推荐范围的抗体浓度可能导致标记不足或过多。

大约 100%。

对于 Mix-n-Stain™ CF® 染料、生物素、花青染料、FITC 和半抗原抗体标记试剂盒，混合成分（抗体、染料和反应缓冲液）只需 30 秒或更短时间。再经过 15 分钟的免提反应时间后，您就完成了！您可以立即使用该抗体对样品进行染色，以用于显微镜检查、流式细胞术、Western 分析或其他需要荧光标记抗体的应用。

Mix-n-Stain™ CF® 染料、生物素、花青染料、FITC 和半抗原抗体标记试剂盒中的标记反应将在 15 分钟后完成。然而，较长的反应时间不会对标记产生不利影响。

否。Mix-n-Stain™ 试剂盒针对 1 次标记进行了优化。我们不建议尝试拆分试剂盒以标记多种抗体或用于多种用途。

如果在 4°C 下储存在 Mix-n-Stain™ 储存缓冲液中，您的标记抗体至少可稳定六个月。如需长期储存，您可以将抗体分装并储存在 -20°C 下。

我们现在提供Mix-n-Stain™ 纳米抗体标记试剂盒，专为使用 CF® 染料优化单域纳米抗体标记而设计。

我们也有客户报告使用我们的原始 CF® Dye Mix-n-Stain™ 抗体标记试剂盒成功标记了纳米抗体。Mix-n-Stain™ 试剂盒针对每个抗体使用 4-6 种染料标记整个 IgG (150 kDa) 进行了优化。由于它们的尺寸较小 (~15 kDa)，单链抗体具有较少的潜在标记位点。因此，为了增加单链抗体的标记程度，我们建议使用更高的染料与蛋白质的比例。例如，Mix-n-Stain™ 50-100 ug 大小的试剂盒可用于标记 25-30 ug 的纳米抗体。此外，我们不建议将 10K MWCO 超滤瓶用于小于 30 kDa 的蛋白质。如果在 Mix-n-Stain™ 标记之前需要超滤，则应改用3K MWCO 超滤瓶（目录号22018 ）。

客户报告成功标记纳米抗体和单链抗体。我们现在提供Mix-n-Stain™ 纳米抗体标记试剂盒，专为使用 CF® 染料对纳米抗体进行最佳标记而设计。

Mix-n-Stain™ 试剂盒标记条件可能导致 IgM 抗体变性。还有已发表的关于酶和凝集素的 Mix-n-Stain™ 标记的报告。请注意，任何结合方法，包括 Mix-n-Stain™，都可能影响蛋白质的生物活性。此外，在 Mix-n-Stain™ 标记后可能会残留一些游离的非反应性染料，这可能会干扰使用荧光标记蛋白质进行的活细胞染色或运输研究。如有必要，试剂盒中提供的超滤瓶可用于在标记后去除游离染料。

另请参阅我们的CF® Dye SE 蛋白质标记试剂盒，其中包括标记和纯化高达 3 mg 蛋白质所需的一切。我们还提供VivoBrite™ 抗体标记试剂盒，用于使用近红外 CF® 染料标记抗体或其他蛋白质，用于小动物体内成像。

我们的 Mix-n-Stain™ 试剂盒专为标记抗体而设计，不适用于标记寡核苷酸。要使用 CF® Dyes 标记寡核苷酸，请参阅常见问题解答CF® Dyes 可以用于标记寡核苷酸吗？

目前，我们没有任何产品可将 DNA 与 HRP 或其他酶结合。但是，您可以从寡核苷酸供应商处订购预结合 HRP 的寡核苷酸。

是的，Mix-n-Stain™ 试剂盒可用于标记含有防腐剂 ProClin™ 300 的抗体。

ProClin 是陶氏化学公司的商标。

直接免疫荧光检测可能不如间接检测敏感。与间接免疫荧光染色相比，您可能需要使用更高浓度的抗体或更高的增益设置才能获得相似的染色强度。在我们的内部测试中，与直接免疫荧光染色相比，间接免疫荧光染色可产生约 3 倍的信号放大。

Mix-n-Stain™ 试剂盒含有极少量的染料或生物素，通常在干燥状态下不可见。将抗体溶液加入小瓶并混合后，溶液颜色会变得鲜艳。生物素、CF™350、CF™405M 和 CF™405S Mix-n-Stain™ 化合物可产生无色或非常浅的溶液，但请放心，小瓶中确实含有染料或生物素。

对于 CF® 染料、生物素、dig 或 DNP 试剂盒，请下载更新的产品方案并按照故障排除清单对 Mix-n-Stain™ 标记和后续染色进行逐步故障排除。

请注意，Mix-n-Stain™ Maxi 1 mg Scale Kits、Mix-n-Stain™ 荧光蛋白标记试剂盒（R-PE、APC、PerCP 或串联染料）、Mix-n-Stain™ 酶标记试剂盒（AP、 HRP、GOx) 具有不同的兼容性要求和标签协议。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数日，因此产品很可能仍能正常工作。为了安全起见，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前，先进行小规模的阳性对照实验，以确认该产品仍然适用于您的应用。

我们知道的一个例外是 GelGreen™，它比我们大多数其他荧光染料对光照更敏感。如果 GelGreen™ 长时间（数天至数周）暴露在环境光下，其颜色将从深橙色变为砖红色。如果发生这种情况，GelGreen 将不再适用于凝胶染色。

生物科学试剂盒
产品信息表上列出了自收到生物科学试剂盒之日起保证的保质期。一些套件在套件盒标签上印有有效期，这是从产品从我们工厂发货之日算起的保证保质期。套件的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧试剂盒，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该试剂盒仍适用于您的应用。

抗体和其他偶联物
产品信息表上列出了抗体和偶联物自收货之日起的保证保质期。抗体和其他结合物的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧偶联物，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该产品仍适用于您的应用。

对于冻干抗体，我们建议用甘油和抗菌防腐剂（如叠氮化钠）重构抗体以获得最长的保质期（请注意，叠氮化钠与 HRP 偶联物不相容）。

化学品、染料和凝胶染色剂
Biotium 保证化学品、染料和凝胶染色剂在您收到产品之日起至少一年内保持稳定。然而，只要按照建议储存，这些产品中的大多数在多年内都非常稳定。存储条件可在产品信息表或产品安全和数据表、材料安全数据表以及产品标签上找到。荧光化合物应避光以便长期储存。

如果您希望使用已储存超过一年的 Biotium 化合物，我们建议您进行小规模阳性对照实验，以确认该化合物在处理大量样品或珍贵样品之前仍适用于您的应用样品。

基于生产日期的有效期 (DOM)
如果您的机构要求您记录基于试剂生产日期的有效期，请联系 techsupport@biotium.com 寻求帮助。

有特殊稳定性考虑的化工产品：

酯类

酯类化合物包括：
• 琥珀酰亚胺酯（SE，也称为 NHS 酯），例如我们的胺反应性染料
• 乙酰氧基甲基酯（AM 酯），例如我们的膜渗透性离子指示剂染料
• 二乙酸酯改性染料，例如 ViaFluor ™ 405、CFDA 和 CFDA-SE 细胞活力/细胞增殖染料

只要避光和防潮，酯类染料在固体形式下是稳定的。酯在水溶液中不稳定。应在无水 DMSO中制备浓缩储备液（参见 Biotium 目录号90082）。无水 DMSO 中的储备液可在 -20°C 下干燥保存一个月或更长时间。酯类应在使用前立即用水溶液稀释。琥珀酰亚胺酯 (SE) 应溶解在不含会与 SE 官能团反应的含胺化合物（如 Tris、甘氨酸或蛋白质）的溶液中。AM 酯和二乙酸化合物应溶解在不含血清的溶液中，因为血清可能含有会水解该化合物的酯酶。

关于 CF® 染料琥珀酰亚胺酯稳定性的说明

琥珀酰亚胺酯 (SE) 通常容易水解，从而导致标记效率降低。许多用于生命科学研究的市售荧光染料都是高度磺化的染料，这使得它们特别容易吸湿，从而加剧了水解问题。此外，对于几种市售的 SE 活性染料，SE 基团衍生自芳香族羧酸，而 Biotium 的所有 CF® 染料中的 SE 基团均由脂肪族羧酸制备。这种结构差异降低了 CF® Dye SE 反应基团对水解的敏感性，从而产生相对稳定的活性染料，与其他荧光染料的其他 SE 衍生物相比，标记效率始终更高。

马来酰亚胺、MTS 和硫代硫酸盐染料
与琥珀酰亚胺酯染料一样，这些染料也容易水解，尽管水解程度通常要低得多。因此，对于长期储存，建议使用无水 DMSO 制备储备液。

其他活性染料
胺类、氨氧基（也称为甲醛）、酰肼、叠氮化物、炔烃、BCN 和酪胺类活性染料，以及染料游离酸，在-20°C 下储存 6-12 年时通常在水溶液中稳定几个月或更长时间，只要不存在可能与染料的官能团发生反应的化合物。有关特定活性染料的更多信息，请参阅产品信息表。

腔肠素和 D-荧光素

按照建议储存时，腔肠素以固体形式稳定；它们在水溶液中不稳定。应在乙醇或甲醇中制备浓缩腔肠素储备液（通常为 1-100 mg/mL）；不要使用 DMSO 或 DMF 溶解腔肠素，因为这些溶剂会氧化化合物。腔肠素的乙醇或甲醇库存可在 -20°C 或以下储存六个月或更长时间；酒精储备在储存过程中可能会蒸发，因此请使用密封的螺旋盖小瓶并用封口膜包裹小瓶以进行长期储存。丙二醇也可用作溶剂以减少蒸发。如果溶剂蒸发，腔肠素仍会存在于小瓶中，因此在储存前记下小瓶中的体积，以便您可以根据需要调整溶剂体积以校正蒸发。使用前立即在水性缓冲液中制备工作溶液。腔肠素在水溶液中最多可稳定 5 小时。

Aquaphile™ 腔肠素是腔肠素的水溶性制剂。当按照建议储存时，它们以固体形式稳定。Aquaphile™ 腔肠素应在使用前立即溶解在水溶液中。它们在水溶液中最多可稳定 5 小时。

请注意，腔肠素主要是黄色固体，但可能含有深红色或棕色斑点。这不会影响产品稳定性或性能。如果您的腔肠素呈均匀的棕色，则说明它已被氧化，需要更换。

D-荧光素在固体形式下是稳定的，并且在按照建议储存时作为浓缩储备液；它在水溶液中的稀释工作浓度下不稳定。在水中制备浓缩的 D-荧光素储备溶液（通常为 1-100 mg/mL），并在 -20°C 或更低温度下分装储存六个月或更长时间。使用前立即准备工作解决方案。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数天，但我们建议在 4°C 或 -20°C 下储存以延长保质期。对于我们的许多染料水溶液，这些化合物在室温下非常稳定，但我们建议冷藏以防止霉菌或其他微生物随着时间的推移而生长。因此，为节省运输成本，建议在 4°C 或 -20°C 下储存的产品可以在环境温度下或使用冰袋运输。这些产品可能会解冻而不影响产品性能。当您收到产品时，请将其置于推荐的存储条件下。

一些产品随附蓝色冰袋作为额外的高温预防措施。蓝色冰袋可在到达时解冻，而不会影响产品性能。

与其他 caspase-3 底物一样，NucView® 488 Caspase-3 底物基于也可被 caspase-7 切割的 DEVD 序列。

单击此处查看据报道可与 NucView® Caspase-3 底物一起使用的原代细胞类型和永生化细胞系列表。

底物非常稳定。一些用户报告使用 NucView® 488 Caspase-3 底物进行时程分析 4-5 天。

NucView® caspase-3 底物具有活性依赖性，即需要活性 caspase-3 酶。在死亡、固定和保存的细胞或组织切片中，没有活性半胱天冬酶，因此不能使用这些底物。我们还提供适用于固定细胞和组织细胞凋亡检测的TUNEL 检测试剂盒。该试剂盒采用与我们异常明亮且耐光的 CF® 染料偶联的 dUTP，用于 DNA 链断裂的单步荧光 TUNEL 标记，这是凋亡细胞的标志，适用于通过荧光显微镜或流式细胞术进行分析。

NucView® Caspase-3 底物可以在实验开始或结束时添加到细胞中。与其他细胞凋亡检测相比，NucView® Caspase-3 Substrates 的主要优势在于它可用于实时监测 capase-3 活性。

是的。我们建议在 2-4% 多聚甲醛中温和固定 10-15 分钟。过度固定会导致信号减弱。NucView® 488 染色可以承受 0.1% Triton X-100 的渗透作用。不推荐使用甲醇固定。

是的。NucView® Caspase-3 底物与流式细胞仪和其他具有适当激发和发射设置的仪器兼容。

NucView® Caspase-3 底物尚未经过 Biotium 对活组织染色的验证。但是，我们收到了一位成功使用 NucView® 488 Caspase-3 底物进行活斑马鱼胚胎染色的客户的反馈。NucView® Caspase-3 底物不能用于固定细胞或组织。

As with all fluorescence based probes, bleaching will occur over time. How long you can view NucView® staining under the microscope depends on several factors including the initial signal strength and the intensity of the excitation source. Some users have reported monitoring NucView® for 4-5 days. You can see a time-lapse video of NucView® staining over 24 hours here:

https://biotium.com.cn/pc/jishuxq?classifyId=20230110134212001614131020

NucView® 488 活细胞检测试剂盒 (30029)含有 0.2 mM 的 NucView® 488 底物，溶于 DMSO 和 caspase-3 抑制剂 Ac-DEVD-CHO。试剂盒测定中的最终 DMSO 浓度可能相当高，这对于敏感细胞类型而言是不可取的。因此，我们提供 DMSO ( 10402 ) 中 1 mM 和 PBS ( 10403 )中 1 mM 的NucView® 488 Caspase-3 底物，因此客户可以在他们的检测中控制 DMSO 的量。请注意，在非 DMSO 敏感细胞类型中，在底物孵育期间添加 DMSO 可以增强 NucView® 染色。

我们还提供溶于 DMSO ( 10405 ) 和 PBS ( 10407 ) 的蓝色荧光 NucView® 405，以及溶于 DMSO ( 10406 ) 和 PBS ( 10408 ) 的橙色荧光 NucView® 530。

DEVD-CHO 是一种可逆抑制剂，可能无法充分阻断 caspase-3 活性。在实验开始时（在细胞凋亡诱导之前或之时）添加不可逆抑制剂如 DEVD-FMK 可能更有效地抑制 caspase 活性。

我们目前提供三种染料颜色的 NucView®：绿色（我们原来的 NucView® 488）、蓝色（NucView® 405）和橙色（NucView® 530）。NucView® 的其他颜色正在开发中。

我们的 NucView® 底物检测半胱天冬酶 3 和 7 的切割。我们目前没有用于其他半胱天冬酶的 NucView® 底物。

阳离子染料广泛用作线粒体探针。它们在细胞内积累并优先定位于线粒体基质中，这是由活细胞中线粒体与质膜电位相比更大的负膜电位引起的。膜电位在控制染料在质膜上的分布方面起着直接的作用：电位越负，带正电的染料积累得越多。MitoView™ 633是一种阳离子亲脂性染料，与TMRM、TMRE和Rhodamine-123等经典染料类似，具有电位依赖性，并与电子梯度成比例地在线粒体中积累。

像JC-1这样的比率染料构成了另一类电位依赖性线粒体染料。在正常的健康细胞中，JC-1 在线粒体中积累并以电位依赖性方式进行聚集，而在不健康、凋亡或垂死的细胞中，线粒体电位消散，染料离域到胞质溶胶，在那里它解离成单体状态。聚集染料（J-聚集体）发出红色荧光，而单体染料发出绿色荧光。

一些线粒体特异性染料被认为是“结构”染料，而不是“功能”染料，因为无论极化状态如何，它们都能染色线粒体。用这些染料染色的细胞的荧光与其线粒体含量或“线粒体质量”成正比。MitoView™ Green是一种不依赖电位的染料，在线粒体中积累并通过疏水相互作用与线粒体基质相互作用。它可用于染色活细胞和甲醛固定细胞中的线粒体。MitoView™ Green 染色与溶剂型固定剂或透化不相容。壬基吖啶橙 (NAO)是另一种与电位无关的线粒体染料，可特异性结合线粒体内膜中的心磷脂。然而，与活细胞染色相比，固定细胞的线粒体染料染色通常特异性较低。对于固定细胞染色，我们建议使用我们的一种 CF® Dye 偶联线粒体标记抗体。

RedDot™ 1 和 RedDot™ 2 与 DNA 结合的机制尚未确定。然而，根据染料结构，它可能通过与 DRAQ®5 类似的机制结合，文献报道DRAQ®5 是一种浓度依赖性嵌入剂和小沟结合剂。

DRAQ 是 Biostatus, Ltd. 的注册商标。

TrueBlack® 和 TrueBlack® Plus 本质上是疏水性的，主要通过疏水相互作用淬灭脂褐素自发荧光。因此，它们可以染色/结合脂质结构并淬灭 BODIPY 和其他脂滴染色剂的荧光信号。此外，原始 TrueBlack® #23007 用于 70% EtOH，这可能会干扰脂滴形态并影响染色。另一方面，TrueBlack® Plus #23014 可代替 70% 乙醇在缓冲液中使用，可能更适合与脂滴染色结合使用。然而，由于 TrueBlack® Plus 的结合也依赖于疏水相互作用，我们建议测试 TrueBlack® 预处理和后处理与您的样品类型中脂滴染色的相容性。

线粒体染料，包括MitoView™ 线粒体染料，带正电且亲脂。由于线粒体中的质子梯度，它们被动地扩散穿过细胞膜并被推测在线粒体基质中积累（有关详细审查，请参见Cytometry Part A79A: 405-425, 2011）。

然而，一些染料在去极化后仍保留在线粒体中。我们的染料化学家假设这是因为一些染料比其他染料更亲脂。一旦它们由于带电而聚集在线粒体中，由于它们的疏水性，它们就不太可能扩散回细胞质，即使在吸引它们的质子梯度被线粒体去极化消散之后也是如此。可能它们与线粒体膜有关。

所谓的电位独立染料，如MitoView™ Green、MitoTracker® Green 和壬基吖啶橙，比电位响应染料（如MitoView™ 633、罗丹明 123和JC-1）疏水性强得多。线粒体去极化后保留前一种染料，可用于测量独立于电位的线粒体质量。然而，将这些染料称为相对电位不敏感而不是电位独立会更准确，因为线粒体电位仍然在它们的定位中发挥作用。据报道，这些染料在去极化时显示出一些信号损失（Cytometry 39(3):203-10, 2000）。

还有一类线粒体染料根据电荷聚集在线粒体中，但也有一个反应基团，可以将染料共价连接到线粒体内的蛋白质靶标上，使它们在固定和透化后能够很好地保留。我们的MitoView™ Fix 640  就是这种类型的染料。

一些染料，如MitoView™ Green可以染色已经固定的细胞中的线粒体。发生这种情况的机制尚不清楚。固定后，线粒体中应该没有质子梯度来吸引染料。我们的化学家怀疑固定线粒体中可能存在一些残余膜电位，这不是由于质子梯度（固定后会消失），而是由于具有不同等电点（净电荷）的蛋白质分布不均匀。有报道称，细胞器中常驻蛋白的净电荷因细胞室的 pH 值而异（Proc Natl Acad Sci USA 115(46):11778-11783, 2018). Charge differences may be sufficient to attract cationic lipophilic dyes to mitochondria in the absence of a proton gradient, due to a combination of weak electrostatic and hydrophobic interactions with mitochondrial proteins and membranes.

However, currently there is no direct evidence to suggest this is the mechanism for MitoView™ Green staining of fixed cells. There may be other targets that the dye is binding. For example, Nonyl Acridine Orange is reported to bind cardiolipin, a lipid that is enriched in mitochondrial membranes. It’s possible that MitoView™ Green binds to particular molecules in mitochondria with some degree of specificity. However, staining of fixed cells with mitochondrial dyes generally is not as specific as staining of live cells. That’s why we recommend using mitochondrial marker antibodies instead of dyes to stain fixed cells when possible.

Most of our MitoView™ dyes are sensitive to mitochondrial membrane potential to some degree, and therefore are recommended for use in live cells only.

我们的MitoView™ Fix 640染料设计用于活细胞染色后可固定。染色与甲醛固定、洗涤剂透化、甲醇固定和随后的免疫荧光染色兼容。MitoView™ Fix 不推荐用于对已经固定的细胞进行染色，因为固定细胞的染色是非特异性的。

MitoView™ Green对线粒体膜电位相对不敏感，可用于对甲醛固定的细胞进行染色（为获得最佳效果，我们建议先固定，再染色）。MitoView™ Green 不能很好地染色用甲醇固定、用清洁剂渗透或石蜡包埋的样品。壬基吖啶橙也染色固定细胞中的线粒体，但固定细胞的染色不是线粒体特异性的（也观察到细胞质和细胞核染色）。一般来说，用线粒体染料对固定细胞进行染色的特异性不如活细胞染色。为在固定细胞或组织切片中染色线粒体时获得最佳结果，我们建议使用我们的一种线粒体标记抗体，可提供多种明亮且光稳定的 CF® 染料和其他偶联物。

LysoView ™ 染料是荧光染料，含有弱碱性胺，在溶酶体的低 pH 环境以及细胞中的其他酸性区室（包括早期和晚期内体）中积累。虽然 LysoView™ 540 和 LysoView™ 640 的荧光对 pH 值的升高很敏感，但很难根据荧光强度明确区分早期和晚期内体或溶酶体。使用针对早期或晚期内体标记或隔室特异性（GFP 或其他）融合结构的抗体会更合适。

其他可能适用于监测内吞作用和囊泡运输的选项包括CF® 染料葡聚糖、CF® 染料酰肼、CF® 染料人转铁蛋白结合物、CF® 染料霍乱毒素亚基 B 和神经末梢染色试剂盒。

ViaFluor® Live Cell Microtubule Stains 是细胞可渗透的紫杉醇探针，用于对活的哺乳动物细胞中的微管细胞骨架进行成像。我们没有这些探针对植物细胞壁的渗透性数据。根据文献，与动物微管蛋白相比，植物微管蛋白与紫杉醇的结合较弱，因此染色可能较弱或不存在。我们确实提供低成本的试用尺寸以供评估。

细胞内脂滴是参与脂质储存和调节的细胞质细胞器。LipidSpot™ Lipid Droplet Stains 是一种能在脂滴中快速积累的荧光中性脂质染料。在甘油三酯和胆固醇酯等中性脂质存在的情况下，它们会发出明亮的荧光。

LipidSpot™ 染料可用于新鲜或 PFA 固定的组织冷冻切片，类似于尼罗红或 BODIPY 染料。然而，脂滴可能无法很好地固定在组织切片中，因此离散脂滴染色可能无法保留。不推荐石蜡包埋切片，因为石蜡组织处理会提取细胞脂质。同样，冷冻切片的甲醇或丙酮固定可能会提取脂质，因此不推荐使用。

封片剂也可能会破坏 LipidSpot™ 染色。我们建议在 PBS 中封固组织切片，或使用EverBrite™ 封固剂等基于甘油的封固剂，并在封固后一天内成像。FluoroShield 封片剂与 LipidSpot™ 染色不兼容。

由于染料与甘油或其他有助于在盖玻片和载玻片之间形成界面的成分相互作用，因此封片剂可以改变 LipidSpot™ 等亲脂性染料的染色。封固剂中的抗褪色化合物通常与染料相容。在我们的测试中，LipidSpot™ 染色在EverBrite™ 封片剂（货号 23001/23002）中保存完好长达 24 小时封片后，但脂滴大小和染色强度在样品储存在封片剂中一段时间后有所改变几天。因此，如果需要安装介质对样品进行成像，我们建议在安装后尽快成像。

LipidSpot™ 与 FluoroShield 封固剂不兼容（封固后染色会立即消失）。我们没有测试其他类型的封固剂。

PMA 在水中稀释至 0.2 mM 后是稳定的，只要它避光并且可以像 20 mM 储备溶液一样储存。

Viability PCR 最初使用 EMA（单叠氮化乙锭）来灭活死细胞 DNA。Biotium 与蒙大拿州立大学的研究人员合作开发了 PMA（单叠氮丙啶）（Nocker 等人，2006 年）。PMA 比 EMA 对死细胞更具选择性，因此被广泛用于活微生物和病毒的选择性检测。PMAxx™是 Biotium 最新的活性 PCR 染料，旨在比 PMA 更有效地消除死细胞 DNA 的 PCR 扩增。因此，它提供了活细菌和死细菌之间的最佳区分。

详细了解用于活力 PCR 的 PMA 和 PMAxx™。

PMA 和 PMAxx™ 均以 20 mM 的水溶液形式提供。我们还提供固体 PMA，客户经常询问是否需要将其溶解在 DMSO 中。虽然在一些出版物中用户已经在 DMSO 中准备了他们的 PMA 库存解决方案，但这不是必需的。与不溶于水的旧活性染料 EMA 不同，PMA 和 PMAxx™ 非常易溶于水。

我们比较了 PMA 和 PMAxx™ 在活力 PCR 测定中区分活细胞和死细胞的能力，并且在所有测试的细菌菌株中*，PMAxx™ 具有更好的活性。因此，虽然我们没有测试每一种细菌菌株，但我们推荐使用PMAxx™进行细菌活力 PCR。

Randazzo 等人最近发表的一篇文章。比较了诺如病毒中的几种活性 PCR 染料，发现 PMAxx™ 对该生物体的效果最好。

我们还将 PMA 和 PMAxx™ 在生存力 PCR 测定中与酿酒酵母进行了比较，发现 PMA 等于或优于 PMAxx™。因此，我们建议将PMA用于酵母和真菌活力 PCR。

*E。大肠杆菌、肠沙门氏菌、李斯特菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌和干酪乳杆菌。

许多用户在环境样品的活力 PCR 中成功使用 PMA，但这些样品可能比纯培养物更具挑战性。我们在下面概述了一些挑战。

水样为了对水样进行活性 PCR，一些用户开发了将微生物浓缩到 0.45 um 过滤器上，然后用 PMA 处理过滤器的方法。可以在本出版物中找到示例协议：Ditommasso S. 等人。(2015) 用于检测军团菌的 Viability-qPCR：基于不同扩增子长度的两种检测方法的比较。摩尔。细胞探针。内政部：10.1016/j.mcp.2015.05.011。 

不透明或复杂样品PMA 活力 PCR 已成功用于各种复杂样品类型，例如污水或土壤。目前还没有关于复杂样品中 PMAxx™ 的报告，但我们预计它的效果与 PMA 一样好或更好。复杂样品的主要考虑因素是染料浓度和光穿透。通常需要更高的染料浓度（100 uM 或更高），因为一些染料可能会与样品中的污染物结合。可能需要更长的光处理和光处理期间更多的混合，因为光更难穿透样品。可以在本出版物中找到一个示例协议：Guo F. 和 Zhang T. (2014) Detecting the nonviable and heat-tolerance bacteria in activated sludge通过最小化死细胞中的 DNA。微生物。生态学。dio 10.1007/s00248-014-0389-2。

使用 PMA 的活力 PCR 已在数百种出版物中发表，涉及数十种不同的生物体和许多不同类型的样本。有关更多信息，请参阅我们的PMA 出版物列表或搜索您感兴趣的应用的文献。

PMA 和 PMAxx™ 染料只要避光（例如，储存在原装琥珀色小瓶中）就具有化学稳定性。我们已通过 HPLC 分析确认染料在环境温度下放置 10 天后不受影响。

在我们的标准活力 PCR 测定方案中，我们说在 PMA 处理后，DNA 应该在用作 PCR 模板之前从细胞中纯化。然而，有报道称在 PMA 处理后成功使用细菌细胞裂解物进行活力 PCR。主要考虑是确保在制备裂解物之前所有染料都被有效地光解。裂解物中未反应的 PMA 染料可能通过与 DNA 或聚合酶结合而抑制 PCR 反应。如果您正在考虑尝试此方法，我们建议在染料和光处理后将细胞造粒，以去除溶液中多余的游离染料。此外，应进行对照实验以确定不会导致 PCR 抑制的理想 PMA 和光处理条件。

PMA 和 PMAxx™ 是膜不透性染料，可选择性地修饰膜受损的死细胞中的 DNA。因此，样本不应在 PMA 处理前冷冻，因为这会使活细胞膜渗透到染料中，并且会丢失活/死细胞的辨别能力。

PMA 处理和光解后，PMA 或 PMAxx™ 与死细胞 DNA 共价连接，溶液中任何多余的染料都应被光解并呈现非反应性。此时可以冷冻细胞，以便在 DNA 提取和 PCR 之前储存。对于完整的细胞恢复，我们建议在冷冻前将细胞沉淀并去除上清液。

PMA 和 PMAxx™ 染料对光非常敏感。光照，甚至室内环境光，都会导致染料分子发生化学变化。因此，我们建议 PMA 或 PMAxx™ 染料的小瓶只能在黑暗的房间或非常昏暗的光线下打开。如果您担心染料可能失去活性，我们始终建议您进行小型测试实验。

对于某些细菌菌株，我们出售完整的活性 PCR 试剂盒，其中包括已在 Biotium 以及大多数情况下在出版物中验证的菌株特异性引物组。然而，任何经过验证的引物组都可用于靶向您感兴趣的物种。我们和其他人发现扩增子长度会影响您的生存能力 PCR 结果。使用更长的扩增子通常可以更好地抑制死细胞 PCR 产物。有关示例，请参阅此出版物：Banihashimi A.，等。(2012) 长扩增子单叠氮丙啶-PCR 计数法检测活的弯曲杆菌和沙门氏菌。J. 申请。生物醇。dio 10.1111/j.1365-2672.2012.05382.x。

虽然您可以使用 100 bp 的短扩增子进行活性 PCR，但我们建议您使用更长的扩增子以获得更好的结果。

不可以，只有在研究革兰氏细菌时才应使用 PMA Enhancer。PMA Enhancer 对革兰氏+细菌有不利影响。

Biotium 提供PMA-Lite™ LED 光解装置，用于 PMAxx™ 和 PMA 与 dsDNA 的光诱导交联。PMA-Lite™ 专为微量离心管中的样品而设计。

Commercial halogen lamps (>600 W) for home use have been employed for photoactivating PMA in some publications, though results may be less consistent due to variation in the set-up configurations. If you decide to use a halogen lamp, place the tubes on a block of ice on a rocking platform to ensure continuous mixing. We recommend freezing water in a clear tray to make the ice block, and placing a piece of aluminum foil under the tray to reflect light upward toward the bottom of the tubes. Set the lamp 20 cm above the samples, so that the light source is pointing downward onto the samples (up to 45° downward slant is OK). Expose samples to light for 5-15 min while rocking.

PMA-Lite 中的 LED 亮度为 600-800 毫坎德拉 (mcd)。每个灯管旁边有三个 LED（一个底部，两侧），波长为 465-475 nm。

PMA-Lite™ 上的每个灯管位置都由三个 LED 灯泡照亮。我们尚未测试位置可变性，但很可能光照在不同位置和设备之间略有不同。然而，每个位置的照明都非常明亮，远远超过活性染料 EMA、PMA 或 PMAxx™ 与核酸光交联所需的亮度，因此任何变化都不会显着影响 vPCR 结果。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数日，因此产品很可能仍能正常工作。为了安全起见，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前，先进行小规模的阳性对照实验，以确认该产品仍然适用于您的应用。

我们知道的一个例外是 GelGreen™，它比我们大多数其他荧光染料对光照更敏感。如果 GelGreen™ 长时间（数天至数周）暴露在环境光下，其颜色将从深橙色变为砖红色。如果发生这种情况，GelGreen 将不再适用于凝胶染色。

生物科学试剂盒
产品信息表上列出了自收到生物科学试剂盒之日起保证的保质期。一些套件在套件盒标签上印有有效期，这是从产品从我们工厂发货之日算起的保证保质期。套件的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧试剂盒，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该试剂盒仍适用于您的应用。

抗体和其他偶联物
产品信息表上列出了抗体和偶联物自收货之日起的保证保质期。抗体和其他结合物的功能通常比保证的保质期长得多。如果您希望使用存储中的旧偶联物，我们建议在处理大量样品或珍贵样品之前进行小规模阳性对照实验以确认该产品仍适用于您的应用。

对于冻干抗体，我们建议用甘油和抗菌防腐剂（如叠氮化钠）重构抗体以获得最长的保质期（请注意，叠氮化钠与 HRP 偶联物不相容）。

化学品、染料和凝胶染色剂
Biotium 保证化学品、染料和凝胶染色剂在您收到产品之日起至少一年内保持稳定。然而，只要按照建议储存，这些产品中的大多数在多年内都非常稳定。存储条件可在产品信息表或产品安全和数据表、材料安全数据表以及产品标签上找到。荧光化合物应避光以便长期储存。

如果您希望使用已储存超过一年的 Biotium 化合物，我们建议您进行小规模阳性对照实验，以确认该化合物在处理大量样品或珍贵样品之前仍适用于您的应用样品。

基于生产日期的有效期 (DOM)
如果您的机构要求您记录基于试剂生产日期的有效期，请联系 techsupport@biotium.com 寻求帮助。

有特殊稳定性考虑的化工产品：

酯类

酯类化合物包括：
• 琥珀酰亚胺酯（SE，也称为 NHS 酯），例如我们的胺反应性染料
• 乙酰氧基甲基酯（AM 酯），例如我们的膜渗透性离子指示剂染料
• 二乙酸酯改性染料，例如 ViaFluor ™ 405、CFDA 和 CFDA-SE 细胞活力/细胞增殖染料

只要避光和防潮，酯类染料在固体形式下是稳定的。酯在水溶液中不稳定。应在无水 DMSO中制备浓缩储备液（参见 Biotium 目录号90082）。无水 DMSO 中的储备液可在 -20°C 下干燥保存一个月或更长时间。酯类应在使用前立即用水溶液稀释。琥珀酰亚胺酯 (SE) 应溶解在不含会与 SE 官能团反应的含胺化合物（如 Tris、甘氨酸或蛋白质）的溶液中。AM 酯和二乙酸化合物应溶解在不含血清的溶液中，因为血清可能含有会水解该化合物的酯酶。

关于 CF® 染料琥珀酰亚胺酯稳定性的说明

琥珀酰亚胺酯 (SE) 通常容易水解，从而导致标记效率降低。许多用于生命科学研究的市售荧光染料都是高度磺化的染料，这使得它们特别容易吸湿，从而加剧了水解问题。此外，对于几种市售的 SE 活性染料，SE 基团衍生自芳香族羧酸，而 Biotium 的所有 CF® 染料中的 SE 基团均由脂肪族羧酸制备。这种结构差异降低了 CF® Dye SE 反应基团对水解的敏感性，从而产生相对稳定的活性染料，与其他荧光染料的其他 SE 衍生物相比，标记效率始终更高。

马来酰亚胺、MTS 和硫代硫酸盐染料
与琥珀酰亚胺酯染料一样，这些染料也容易水解，尽管水解程度通常要低得多。因此，对于长期储存，建议使用无水 DMSO 制备储备液。

其他活性染料
胺类、氨氧基（也称为甲醛）、酰肼、叠氮化物、炔烃、BCN 和酪胺类活性染料，以及染料游离酸，在-20°C 下储存 6-12 年时通常在水溶液中稳定几个月或更长时间，只要不存在可能与染料的官能团发生反应的化合物。有关特定活性染料的更多信息，请参阅产品信息表。

腔肠素和 D-荧光素

按照建议储存时，腔肠素以固体形式稳定；它们在水溶液中不稳定。应在乙醇或甲醇中制备浓缩腔肠素储备液（通常为 1-100 mg/mL）；不要使用 DMSO 或 DMF 溶解腔肠素，因为这些溶剂会氧化化合物。腔肠素的乙醇或甲醇库存可在 -20°C 或以下储存六个月或更长时间；酒精储备在储存过程中可能会蒸发，因此请使用密封的螺旋盖小瓶并用封口膜包裹小瓶以进行长期储存。丙二醇也可用作溶剂以减少蒸发。如果溶剂蒸发，腔肠素仍会存在于小瓶中，因此在储存前记下小瓶中的体积，以便您可以根据需要调整溶剂体积以校正蒸发。使用前立即在水性缓冲液中制备工作溶液。腔肠素在水溶液中最多可稳定 5 小时。

Aquaphile™ 腔肠素是腔肠素的水溶性制剂。当按照建议储存时，它们以固体形式稳定。Aquaphile™ 腔肠素应在使用前立即溶解在水溶液中。它们在水溶液中最多可稳定 5 小时。

请注意，腔肠素主要是黄色固体，但可能含有深红色或棕色斑点。这不会影响产品稳定性或性能。如果您的腔肠素呈均匀的棕色，则说明它已被氧化，需要更换。

D-荧光素在固体形式下是稳定的，并且在按照建议储存时作为浓缩储备液；它在水溶液中的稀释工作浓度下不稳定。在水中制备浓缩的 D-荧光素储备溶液（通常为 1-100 mg/mL），并在 -20°C 或更低温度下分装储存六个月或更长时间。使用前立即准备工作解决方案。

我们的大多数产品在室温下可稳定保存数天，但我们建议在 4°C 或 -20°C 下储存以延长保质期。对于我们的许多染料水溶液，这些化合物在室温下非常稳定，但我们建议冷藏以防止霉菌或其他微生物随着时间的推移而生长。因此，为节省运输成本，建议在 4°C 或 -20°C 下储存的产品可以在环境温度下或使用冰袋运输。这些产品可能会解冻而不影响产品性能。当您收到产品时，请将其置于推荐的存储条件下。

一些产品随附蓝色冰袋作为额外的高温预防措施。蓝色冰袋可在到达时解冻，而不会影响产品性能。

对于冻干（固体）形式提供的染料或试剂，很难根据试管中染料的外观来比较数量，因为在冻干过程中，染料会以不同的方式干燥，要么散布在整个试管中，聚集在一起，或涂在管的侧面或底部。离心管可能无助于将染料固体收集到管底，因为这通常适用于溶液。然而，冻干固体是根据干燥前试剂溶液的高精度吸光度测量进行包装的，因此小瓶中含有正确数量的染料。

腔肠素主要是黄色固体，但可能含有深红色或棕色斑点。这不会影响产品稳定性或性能。如果您的腔肠素呈均匀的棕色，则说明它已被氧化，需要更换。

Biotium 在室温下运输所有抗体（一抗、二抗和偶联物）。根据我们的稳定性测试，我们在这些条件下保证它们的质量和性能。通过将抗体在不同温度（4°C、室温或 37°C）下储存 1 周以模拟模拟运输条件并在免疫染色实验中进行测试，对抗体进行了加速稳定性测试。即使在次优温度下储存一周或更长时间后，所有抗体都显示出预期的亮度和特异性。

为了实现我们通过减少过度包装的使用和降低客户的运输成本来更加环保的目标，通过我们的稳定性测试的产品在室温下运输。

收到抗体瓶后，请按照产品信息 (PI) 表上的长期储存说明进行操作。

Biotium 标签推荐的储存条件是有意保守的。在低温下长期储存通常会增加产品保持在规格范围内的时间，除非另有具体说明（例如“请勿冷藏”或“请勿冷冻”）。

Biotium 标签和产品信息表可能显示长期储存的特定温度，或适合长期储存的温度范围。对于所有产品，以下存储条件的隐含范围如下：

• 室温
  对于标签指示室温或 RT 的 Biotium 产品，这意味着在 20°C 和 30°C 之间的环境条件下储存。

• 冰箱
  对于标签指示 4°C 的 Biotium 产品，这意味着储存在 2°C 和 8°C 之间的冰箱中。

• 冰箱
  对于标签指示 -20°C 的 Biotium 产品，这意味着储存在 -35°C 和 -5°C 之间的冰箱中。

• 超低温冰箱
  对于标签标明 -70°C 的 Biotium 产品，这意味着存储在低于 -60°C 的超低温 (ULT) 冰箱中。

我们的一些大容量光敏产品采用琥珀色瓶或琥珀色玻璃瓶包装，易于处理和避光。然而，琥珀色微型包装瓶（0.5 mL 或 2 mL）使得在制备溶液或移液时很难看到少量染料。因此，我们仅将 PMA 或 PMAxx™ 等光敏染料包装在琥珀色微型包装瓶中。我们的一些活性染料包装在透明小瓶中，然后密封在防潮铝箔袋中，该铝箔袋还可以避光。

透明小瓶中的其他荧光染料应避光保存以便长期保存。可以将未覆盖的染料瓶存放在无窗冰箱或自动关灯的冰柜中。如果染料将储存在玻璃前（熟食店式）冰箱、步入式冰箱/冰柜中，或在室温下持续光照，则应将它们储存在不透明的盒子中（如白色纸板冷冻盒） ，在一个封闭的抽屉里，在一个黑色的塑料袋里，或者用铝箔纸覆盖。

在实验期间在工作台上处理荧光染料时，它们通常对短暂的光照不敏感。为了安全起见，如果染料瓶要在工作台上放置超过 30 分钟左右，我们通常会用一片箔纸松散地盖住试管架。但大多数染料足够稳定，即使不小心将它们放在工作台上一天也不会影响性能。在处理 EMA、PMA 或 PMAxx 等光敏染料时，我们会采取额外的预防措施，将灯光调暗。

化合物溶解度列在产品网页、产品信息表或产品安全和数据表中。查看产品信息表以了解制备储备液的具体说明。储备溶液通常按最终所需工作浓度的 10X-1000X 制备，通常在 1-100 mg/mL 的范围内。对于染料和指示剂，我们通常在推荐的溶剂中制备浓度为 5-10 mM 的浓缩储备液。然后可以在用于应用的缓冲液或介质中将染料稀释至最终所需浓度。

溶解度定义

要溶解冻干化合物，只需将适当体积的推荐溶剂添加到小瓶中，制成所需浓度的储备溶液，然后旋转或轻轻涡旋混合。确保溶剂与小瓶的内壁接触以完全回收产品。

难以溶解的化合物可加热至 50°C 或更高（注意：我们不建议加热腔肠素溶液），并涡旋或超声处理直至完全溶解。一些化合物只是在动力学上缓慢溶解。当化合物是高纯度和结晶形式时尤其如此。另一种更温和的溶解这些化合物的方法是在黑暗中简单地摇晃化合物/溶剂混合物过夜。

When preparing stock solutions in organic solvents such as DMF, DMSO, or alcohol for use in living cells or organisms, make a concentrated stock so that the final concentration of solvent in the working solution will not be toxic. A general guideline for immortalized cell lines is to keep the final solvent concentration below 1%; certain cell lines, primary cells or experimental organisms may be more sensitive to solvent toxicity. Similarly, for enzymatic reactions, the final concentration of solvent should be kept below 1% to avoid inhibiting enzyme activity.

Compounds dissolved in aqueous solution can be sterilized by filtration if necessary. Generally, concentrated stock solutions of compounds in organic solvents do not require sterilization, but culture medium can be sterilized by filtration after addition of the compound.

我们的一些产品采用溶液包装，然后进行溶剂蒸发或冻干。如果化合物的颜色非常浅或无色且数量很少，它可能会薄薄地涂在小瓶壁上，使小瓶看起来是空的。因此，在您要求更换之前，请仔细检查小瓶。

要溶解冻干化合物，只需将适当体积的推荐溶剂添加到小瓶中，制成所需浓度的储备溶液，然后旋转或轻轻涡旋混合。确保溶剂与小瓶的内壁接触以完全回收产品。

请注意，CF™350、CF™405M 和 CF™405S 等蓝色荧光染料是无色或非常淡的黄色，可能很难看清。

我们的许多固体化合物都是通过冻干法包装的，在这种情况下，它们通常不会以蓬松的粉末形式出现，而是在小瓶的侧面形成薄膜或涂层。只需将适当体积的推荐溶剂添加到小瓶中即可制成所需浓度的储备溶液，然后旋转或轻轻涡旋混合。确保溶剂与小瓶的内壁接触以完全回收产品。

AccuOrange™ 测定是一种基于荧光染料的测定。染料主要通过疏水相互作用与蛋白质结合。蛋白质在加热时变性；染料在冷却后与蛋白质暴露的疏水口袋结合。游离的 AccuOrange™ 染料由于非放射性衰变而具有荧光性，但由于口袋内的刚性构象而变得高度荧光。

AccuOrange™ 测定法比 BCA、Bradford 和 Lowry 等传统蛋白质定量测定法更灵敏，并且显示出优于 NanoOrange® 蛋白质定量测定法 (Thermo Fisher Sci.) 的线性度和重现性，但对 SDS 和 Triton® 等去污剂的耐受性较低X-100。

尽管 AccuOrange™ 缓冲液确实含有染料结合蛋白质所必需的 SDS，但该测定对 SDS 浓度的微小变化非常敏感，并且也不能耐受与 SDS 形成混合胶束的非离子洗涤剂，如 Triton®。因此，我们不建议将该试剂盒用于细胞裂解物或其他含有大量去污剂的样品。

使用预染蛋白标记物可以淬灭荧光蛋白染料。切换到未染色的标记应该可以解决问题。

我们不建议在进行蛋白质印迹之前使用 One-Step 蛋白质凝胶染料对聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质进行染色，因为它会显着减少蛋白质向膜的转移。如果需要在转印前在凝胶上检测蛋白质，总蛋白预染液会更合适。

VersaBlot ™ 总蛋白标准化试剂盒可在 SDS-PAGE 凝胶和蛋白质印迹膜上进行简单、灵敏和高度线性的蛋白质定量。这些试剂盒允许您在 SDS-PAGE 上运行样品之前用我们的近红外CF® 染料标记纯化的蛋白质或细胞裂解物。电泳后，可以使用荧光凝胶扫描仪在凝胶上观察条带，允许检测每个条带低至 1 ng 的蛋白质。标记的蛋白质也可以转移到膜上进行蛋白质印迹。该染色在宽动态范围内表现出出色的总蛋白定量线性，优于基于管家蛋白检测的传统蛋白质印迹标准化，并且染色是可逆的。

Lumitein™ 是一种发光染料，设计用于检测 SDS 聚丙烯酰胺 (SDS-PAGE) 凝胶中的蛋白质。如协议PI-21002中所述，它还可用于在额外的 SDS 孵育步骤后检测天然 PAGE 凝胶中的蛋白质。

用 One-Step Blue® 染色的凝胶可以像用考马斯蓝染色的凝胶一样干燥。染料不会干扰放射性标记蛋白的检测。

MTT 和 XTT 是基于比色的测定，而刃天青可以使用比色或荧光检测来测量。MTT 不是可溶性产品，因此在测量吸光度之前必须先裂解细胞以溶解甲臜盐。XTT 和刃天青不需要细胞裂解，允许在不同时间点对相同样品进行动力学监测。

AlamarBlue® 包含刃天青和其他化合物，以防止刃天青过度还原为非荧光产品。这些添加剂还减慢了荧光产物的产生速度。因此，与刃天青相比，alamarBlue® 测定需要更长的孵育时间。

刃天青被细胞还原为荧光产物试卤灵。试卤灵可以进一步还原为非荧光化合物。因此，由于底物的过度还原，最密集的孔可能具有最低的荧光。请参阅产品信息表了解更多详情。套件协议提供了一般指南，可能需要根据经验针对您的实验系统进行优化。您可能需要改变细胞密度或测定孵育时间，以确保您的样品落在试剂盒的线性范围内。

含有酚红的培养基与刃天青测定相容。酚红不干扰刃天青反应，也不影响检测。

基因组 DNA 的污染是一个大问题，因为它会干扰下游应用。RNAstorm™ 试剂盒包括优化的 DNase 消化步骤，可去除污染的基因组 DNA，而不会显着影响 RNA 产量。虽然此步骤是可选的，但强烈建议这样做。

影响获得的 RNA 或 DNA 总量的最重要变量是样品本身的质量（即组织的类型和数量以及分离和保存样品时所采取的措施）。假设样品质量合理，您可以期望使用 RNAstorm™ 或 DNAstorm™ 试剂盒获得超过 1 ug。

是的。只要 RNA 的质量足够高，就可以获得高质量的文库。对于 Illumina 测序，建议 DV200 至少为 30%，并且应使用提供至少 1 µg RNA 的样本。

使用切片机从 FFPE 样品中获取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割，可以使用比 5 µm 更薄的部分。不推荐厚度超过 10 µm 的切片，因为它们可能无法完全消化。此外，每次提取不应使用超过 5 个部分（每个 10 µm）。使用过多的组织会导致消化不完全和产量降低。

是的，未包埋在石蜡中的组织可以与这些试剂盒一起使用。在这种情况下，我们建议机械研磨相当于推荐切片数量的组织。如果您要分离 RNA，我们还提供RNAstorm™ 试剂盒，用于从新鲜或冷冻细胞或组织样本中分离 RNA。

RNAstorm™ FFPE 和 DNAstorm™ FFPE 提取试剂盒包括推荐的脱蜡试剂。与其他常用方法（例如二甲苯）不同，脱蜡试剂高效、无毒且不需要使用通风橱。在我们的测试中，所包含的试剂在去除石蜡和允许纯化高质量核酸方面至少与二甲苯一样有效。

白色混浊层是 Deparaffinization Reagent 和 CAT5 Lysis Buffer 之间的乳液，当这两种试剂涡旋或剧烈混合时可能会形成。为避免此问题，我们建议不要在脱蜡试剂和 CAT5 裂解缓冲液接触时涡旋样品。相反，我们建议在需要时在这两种试剂存在的情况下（例如，添加蛋白酶时）使用移液器进行混合。可以通过以最大速度 (> 16,000 xg) 离心至少 2 分钟来去除白色浑浊层。时间长短取决于乳液的体积。

由于从 FFPE 组织样本中分离出的 DNA 大小分布广泛，我们建议使用脉冲场凝胶电泳 (PFGE)。也可以使用基于毛细管电泳的方法，例如安捷伦生物分析仪，但可能无法正确解析质量较好的样品中的高分子量片段（大于 10kb）。

是的。只要 DNA 质量足够高，就可以获得高质量的文库。

通过在裂解步骤后立即执行优化的 RNase 消化步骤来消除 RNA 的污染。

试剂盒中离心柱的最大容量与标准小量制备柱相似，约 20 微克 DNA。然而，FFPE 提取的预期产量要低得多，每次制备得到超过 1-2 微克的 DNA 是非常罕见的。

FFPE 衍生的 RNA 比从新鲜样品中获得的 RNA 更难以准确定量。仅仅知道存在的 RNA 的绝对量是不够的，还要知道 RNA 是否会在下游应用中发挥作用，这取决于以下因素：

• 片段大小分布：5 µg 样本（由 Qubit 测量）如果包含 < 200 nt 的片段，则对 RNA-Seq 可能无用。

• 化学修饰：对于从福尔马林固定样品中获得的 RNA，各种化学加合物和交联，包括碱基修饰、碱基-碱基交联和碱基-蛋白质交联，可以使核酸分子无法接触酶，因此在下游应用中失去活性。

• 污染：纯化过程中使用的细胞碎片、蛋白质、盐和去污剂可能会影响下游分析。例如，基于 UV/Vis 的方法（如 Nanodrop）特别容易受到在 200-280 nm 范围内吸收的污染物的影响。

• 基于荧光的方法（如 Qubit）容易出现重大错误。当处理低浓度的 DNA 或 RNA 时，基于染料的检测可能不是线性的。还必须注意 RNA 样品中基因组 DNA 的污染，因为用于荧光定量的染料并非完全特异性针对 FFPE 衍生的 DNA 或 RNA。

• 定量 PCR 是对严重受损和修饰的核酸进行定量的首选方法。

尽管 RIN 编号可以提供有关样本碎片化程度的一般信息，但它的灵敏度或可预测性不足以作为下游性能的有用指标，尤其是对于 RNA-Seq。通常，FFPE 衍生 RNA 的 RIN 编号在 2 到 3 之间。这些样本中的一些对 RNA-Seq 有用，而其他样本则不会——但是 RIN 不会告诉您。

使用 Illumina 测序的 RNA-Seq 性能稍微更好的预测指标是 DV200，它代表长于 200 个核苷酸的 RNA 片段的百分比。DV200 也是根据 Bioanalyzer 数据计算的，但与所有基于 Bioanalyzer 的方法具有相同的缺点，特别是高可变性。

• 避免基于有机溶剂的方法 (Trizol)

• 避免苛刻的离液盐（即胍盐）

• 避免使用会影响 UV 和/或 Qubit 下游定量的去污剂（例如 Triton X-100）

• 不要依赖 RIN 来量化 FFPE 衍生样本的完整性，而是使用 DV200。

• 使用从福尔马林中去除化学修饰的试剂盒或方法。请勿将温度升高至 80˚C 或以上。即使在此温度下停留很短时间也会显着降低完整性。

• 小心 Qubit 和 Nanodrop 的浓度，因为可能会被有机分子或 DNA 污染。

• 使用 qPCR 对您的 RNA 进行定量，并始终仔细查看熔解曲线以确定是否发生了非特异性扩增。

当使用大量 FFPE 提取的模板 DNA 时，通常会观察到 PCR 抑制。这种抑制通常不是由于污染物的存在，而是由于 DNA 本身残留的化学修饰和损伤造成的。对 PCR 协议进行几个简单的调整可以解决这个问题。首先，应减少模板 DNA 的量。其次，PCR 聚合酶的量应增加 2-4X。第三，延长退火和延伸时间。第四，可以增加 dNTP 的量。

Dietrich 等人对这个问题进行了深入讨论 。(2013), PLoS ONE 8(10): e77771。

是的，可以依次使用 RNAStorm™ 和 DNAStorm™ FFPE 试剂盒。下面的步骤将使该协议适应于从一个样本中提取 RNA 和 DNA。

首先根据 RNAstorm™ 套件协议提取样本，并进行以下修改：

1.  在 72˚C 下仅进行 30 分钟的第 3 步（通常为 2 小时孵育）。请参阅下面有关此步骤可能优化的注释。

2.  按照指示执行 RNAstorm™ 协议的第 4 步和第 5 步，但不要丢弃第 5 步中的沉淀物（其中包含 DNA）。

3.  按照步骤 6 中的说明将上清液（含有 RNA）转移到新试管中。

4.  继续在 72˚C 下将上清液再孵育 1.5 小时（总共 2 小时，包括最初的 30 分钟），然后按照说明继续进行 RNAstorm™ 方案的第 7 步（添加结合缓冲液）和所有剩余步骤。

5.  使用步骤 2 中包含 DNA 的沉淀作为 DNAstorm™ 试剂盒手册步骤 A5（或 B8，取决于脱蜡选择）的输入。

6.  继续执行 DNAstorm™ 方案的步骤 A5（或 B8），向沉淀中添加 200 µL CAT5™ 缓冲液，然后按照 DNAstorm™ 方案的指示继续。

注意：初始潜伏期可根据相对 DNA 和 RNA 产量进行调整。如果 RNA 产量高但 DNA 产量低，则减少步骤 3 中的孵育时间（不少于 15 分钟）。如果 DNA 产量高但 RNA 产量低，则增加步骤 3 中的孵育时间（不超过 2 小时）。

除非指定为同种型特异性，否则抗 IgG 二抗是针对整个免疫球蛋白产生的，因此预计它们会与 IgG 以外的同种型发生广泛的交叉反应。

不，您并不总是需要使用与二抗相同物种的血清来进行封闭。BSA、鱼明胶、山羊血清或脱脂奶（用于西方）可与来自大多数宿主物种的二抗一起使用。但是，重要的是要避免使用来自同一宿主物种的封闭血清作为您的一抗，而这种抗体是由针对同一物种的二抗检测的（封闭血清中的免疫球蛋白将竞争二级结合）。例如，如果您使用山羊一抗和抗山羊二抗，请避免使用山羊血清进行封闭。

我们的TrueBlack® IF 背景抑制系统和TrueBlack® WB 封闭缓冲液试剂盒包含非哺乳动物来源的蛋白质，不应与哺乳动物或鸡宿主的二抗相互作用。我们的BSA也不含免疫球蛋白，不会干扰二抗。

H+L代表重链和轻链。这意味着抗体将结合目标物种免疫球蛋白的重链（恒定区）和轻链（可变区）上的表位。

“最小 x”后跟一个物种列表表示该抗体与这些物种的抗体具有最小的交叉反应性。该抗体已被所列物种的血清蛋白吸附，以确保它不会与这些物种发生交叉反应。

当对来自不同物种的抗体进行多重染色（例如，与来自小鼠和大鼠宿主的两种不同一抗共染色）或对来自与抗体宿主密切相关的物种的组织（例如如使用小鼠抗体染色大鼠组织）。

当您使用来自不同宿主的两种一抗进行多重染色时，我们建议使用高度交叉吸附的二抗。当用两个密切相关的物种（如小鼠和大鼠）的抗体染色时，使用高度交叉吸附的抗体尤为重要。

当使用来自密切相关物种的一抗对来自物种的组织进行染色时（例如，使用小鼠一抗对大鼠组织进行染色），使用高度交叉吸附的二抗将防止二抗与组织中的内源性免疫球蛋白发生交叉反应的背景. 这在免疫组织染色时很重要，但内源性免疫球蛋白的背景在血管周围的其他组织中很常见，这些组织中的免疫球蛋白也很丰富。

通常，我们建议使用来自同一宿主的二抗进行多重染色（例如，结合山羊抗兔和山羊抗小鼠，或驴抗兔和驴抗小鼠）。如果我们目前不提供您希望使用的特定二抗偶联物，请务必联系我们，我们可以为您进行定制偶联。

根据我们的经验，驴和山羊宿主二抗之间的交叉反应性很低，但不能保证每批抗体都是如此。如果您决定结合来自不同宿主的二抗，我们建议进行适当的对照以确保两种二抗不会相互发生交叉反应。

不，指定为抗 IgG (H+L) 且未指定亚型的抗体将与 IgG 的所有亚型以及其他同种型如 IgM 发生交叉反应，因为它们与重（恒定）和抗体的轻（可变）区域。

与 IgG (H+L) 反应的二抗会与重链和轻链上的表位发生反应，因此它们会与其他同种型的一抗反应，例如 IgM，或 IgG 的不同亚型（IgG2、IgG2a 等） . 针对其反应性指定特定同种型的二抗（例如山羊抗小鼠 IgG2a、同种型特异性）与其他同种型交叉吸附以进行特异性结合。

同种型特异性抗体（例如，山羊抗小鼠 IgG1、山羊抗小鼠 IgG2a 或山羊抗小鼠 IgG2b）可用于特异性检测所列子类的一抗。这对于使用不同同种型的多种小鼠单克隆抗体进行多重检测非常有用。

在用小鼠单克隆抗体对小鼠组织进行染色时，抗小鼠亚型特异性二抗也可用于避免背景，因为 IgG 在大多数小鼠组织中的含量相对较低。

同种型特异性抗体也可用于鉴定单克隆抗体的同种型，或用于染色 B 细胞亚群。

IgY 是哺乳动物 IgG 的鸟类对应物，或鸟类产生的抗体类型。山羊抗鸡 IgY (H+L) 是在山羊宿主中产生的二抗，可与鸡抗体的重链和轻链发生反应。

F(ab) 片段特异性抗体与来自目标物种的免疫球蛋白的轻链而非重链发生反应。它们可用于检测抗体片段，或避免与免疫球蛋白重链发生交叉反应。

F(ab')2 是通过 IgG 的胃蛋白酶消化制备的 IgG 片段。F(ab')2 片段是两个轻链二聚体的二硫键连接的异源二聚体，因此它像整个 IgG 一样保留了二价表位结合，但由于它缺少重链，它的大小更小（~110 kDa 与 150整个 IgG 的 kDa）。

F(ab') 是由单个轻链同型二聚体组成的单价片段，它是通过胃蛋白酶消化 IgG，然后还原轻链二硫键获得的。

F(ab')2 和 F(ab') 片段不与细胞上的免疫球蛋白受体结合，这可用于实现一抗靶标的特异性染色。这些片段也不会结合蛋白 A 或蛋白 G。

TrueBlack® Lipofuscin Quencher可与免疫荧光染色工作流程中的TrueBlack® IF 背景抑制（透化）试剂盒一起使用，以减少非特异性抗体和染料结合的背景，以及样品本身产生的自发荧光。由于 TrueBlack® IF 试剂含有洗涤剂，TrueBlack® 脂褐素淬灭剂需要在免疫染色（后处理方案）后使用，因为后者与 IF 试剂中存在的洗涤剂不兼容。

如果使用不含洗涤剂的缓冲液进行免疫染色，则可在免疫染色之前（预处理方案）或之后使用 TrueBlack 脂褐素淬灭剂。

带有多个负电荷的染料会引入背景。通常，与金环蛇毒素等小毒素相比，携带许多染料的标记抗体更值得关注。对组织进行染色时，组织本身的内源性自发荧光通常是最重要的背景来源。组织中的内源性荧光背景通常在蓝色波长（DAPI 通道）中最高，在远红色（Cy®5 通道）中最低。我们的 CF®633 金环蛇毒素（目录号 00009）是 Cy®5 通道的远红外结合物，具有低负电荷，染料或自发荧光的背景应该很低。

我们在大鼠骨骼肌切片上测试了荧光银环蛇毒素。虽然组织显示自发荧光，但对于我们测试过的所有染料颜色，马达终板的银环蛇毒素染色通常比背景亮得多。但是，如果您对人体组织（尤其是大脑）进行染色，脂褐素自发荧光可能在所有通道中都很亮。这通常表现为细胞核周围明亮的点状点。虽然我们通常会推荐将我们的 TrueBlack® 脂褐素猝灭剂用于人脑组织，但它们与银环蛇毒素染色不兼容。然而，我们发现EverBrite TrueBlack® 封片剂（货号 23017）可用于封片被银环蛇毒素染色的骨骼肌切片。

Cy Dye 是 Cytiva 的注册商标。

TrueBlack® 脂褐质猝灭剂可与原位杂交一起使用。文献中有几个参考文献描述了这一点（下面列出了一些）。

https://idp.nature.com/authorize?response_type=cookie&client_id=grover&redirect_uri=https%3A%2F%2Fwww.nature.com%2Farticles%2Fs41598-017-14484-9。

https://doi.org/10.1101/2020.02.03.931618。

https://doi.org/10.1186/s13195-019-0469-0。

如果使用含有去污剂的溶剂或缓冲液，则应在这些步骤之后进行 TrueBlack 处理，最好是在用 PBS 冲洗切片后进行。由于使用了高盐 SSC 洗涤缓冲液，TrueBlack® 也可能会沉淀出来。在 TrueBlack 处理之前用 PBS 冲洗切片可能有助于最大限度地减少这种情况。

TrueBlack® 脂褐素猝灭剂应使用水基封固剂进行封固。它不能与基于有机溶剂的封片剂（如 Permount™ 或 DPX）一起使用。

TrueBlack® 脂褐素淬灭剂与以下封片剂兼容（含或不含 DAPI）：

EverBrite™ 封固剂
EverBrite™ Hardset 封固剂
Slowfade® Gold (Thermo Fisher Scientific)
Prolong® Gold (Thermo Fisher Scientific)
VECTASHIELD® (Vector Laboratories)
VECTASHIELD® Hardset (Vector Laboratories)
Fluoromount-G® (Southern Biotech)
Fluoromount™ (Sigma) )

Permount 是 Fisher Scientific LLC 的商标；SlowFade 和 ProLong 是 Thermo Fisher Scientific 的注册商标；VECTASHIELD 是 Vector Laboratories 的注册商标；Fluormount-G 是 Southern Biotechnology Associates 的注册商标；Fluoromount 是 Diagnostic Biosystems, Inc. 的商标。

为获得最佳效果，我们建议使用EveBrite™ 封片剂等基于甘油的湿式封片剂封片。猝灭剂还与EverBrite™ Hardset Mounting Medium兼容。

我们还发现这些封片剂与封片 TrueBlack® Plus 处理过的样品兼容。
SlowFade® Gold
SlowFade® Diamond
Prolong® Diamond
Prolong® Glass
Vectashield® Hardset
Vectashield® Vybrance™
Fluoromount-G®
Mowiol® 封固剂

我们不建议使用以下封片剂：
Vectashield® 湿固封片剂
Fluoroshield™

Fluoromount-G 是南方生技的注册商标；FluoroShield 是 ImmunoBioScience Corp 的商标；Mowiol 是 Kuraray Europe GmbH 的注册商标；Slowfade 和 Prolong 是 Thermo Fisher Scientific 的注册商标；Vectashield 是 Vector Laboratories 的注册商标。

TrueBlack® 脂褐素猝灭剂本质上是疏水性的。某些实验条件会导致淬灭剂在处理过的样品上留下沉淀物或团块，从而干扰成像。我们建议将装有 TrueBlack® 储备液的小瓶在 DMF 中 20X 加热至 70ºC 5 分钟。避免这种情况。将 TrueBlack 作为 1X 散装溶液稀释并储存在 70% 乙醇中也有帮助。

TrueBlack® 和 TrueBlack® Plus 本质上是疏水性的，主要通过疏水相互作用淬灭脂褐素自发荧光。因此，它们可以染色/结合脂质结构并淬灭 BODIPY 和其他脂滴染色剂的荧光信号。此外，原始 TrueBlack® #23007 用于 70% EtOH，这可能会干扰脂滴形态并影响染色。另一方面，TrueBlack® Plus #23014 可代替 70% 乙醇在缓冲液中使用，可能更适合与脂滴染色结合使用。然而，由于 TrueBlack® Plus 的结合也依赖于疏水相互作用，我们建议测试 TrueBlack® 预处理和后处理与您的样品类型中脂滴染色的相容性。

TrueBlack® Plus Lipofuscin Autofluorescence Quencher具有细胞膜渗透性，在低浓度下对活细胞无毒。在活细胞中，染料在溶酶体和其他细胞内囊泡中积累。因此，它可能对流式细胞术或显微镜的活细胞自发荧光淬火有用，也可能没有用，具体取决于特定细胞类型中自发荧光和目标探针的来源和定位。

我们在活细胞中测试过的 TrueBlack® Plus 浓度远低于用于组织切片淬灭的浓度，为 0.001X 至 0.005X（对应于 40X 原液的 1:40,000 至 1:8,000 稀释）。可以在细胞培养基中孵育 30 分钟到几天，但毒性可能因细胞类型而异。

我们原创的 TrueBlack® 脂褐素自发荧光淬灭剂（目录号23007）不溶于水性缓冲液或培养基，因此与活细胞染色不兼容。

请参阅下文，了解我们推荐的 Akoya tyramides 替代品。除非注明为直接替代品，否则这些酪胺染料是光谱相似的替代品。它们尚未经过验证可直接替代 Akoya 试剂盒或成像系统。

Akoya Tyramides 的 CF® 染料替代品

注意：此处列出的 CF® 染料是 Opal™ 染料的光谱相似替代品，它们尚未经过验证可直接替代 Akoya 的试剂盒或成像系统。Opal 是 Akoya Biosciences 的商标。

我们的酪胺扩增试剂盒已被证明在多色荧光成像方面稳健且用途广泛，与染料标记的抗体和各种细胞染色方法兼容（见图 1）。

要在一种或多种染料标记的抗体之外使用酪胺扩增试剂盒，请按照试剂盒协议固定和封闭样品；用一抗标记；然后使用二抗检测一抗。染料标记的二抗可以与酪胺试剂盒中的 HRP 偶联二抗或 HRP-链霉亲和素共同孵育。洗涤后，根据试剂盒方案进行 CF® Dye 酪胺反应。酪胺反应不会干扰染料标记抗体或其他荧光染色试剂的结合。

在同一样品上使用一种以上染料酪胺进行多色检测需要顺序进行酪胺染色反应，然后在每个步骤之间进行 HRP 灭活或抗体剥离。

是的，CF® 染料酪胺可用于使用酪胺信号放大1 (TSA) 的原位杂交。它们还与 RISH 2的 RNAscope 检测兼容。

关于增加酪胺孵育时间是否会改善较厚切片的染色，我们没有任何第一手资料。我们已经在 10 um 厚的载玻片冷冻切片上测试了酪胺。40 um 浮动部分的已发布协议建议在室温下执行 tyramide 开发步骤 15 分钟。

如果您使用的是自由浮动切片，通常所有孵育步骤（透化、抗体孵育和洗涤）都比载玻片上的切片长。酪胺是小分子，应该比抗体偶联物更快地穿透组织，但您可能希望测试更长的孵育时间以使缓冲液穿透组织。

Marker的加样量：marker有一个推荐浓度范围，选择最高的，样品与Marker含量差别大, 也会造成条带错误（这不会是染料的问题，用EB也会存在该问题）。正确的DNA上样量是条带清晰的保证。Marker应该选择在目标片段大小附近的梯带较密的，这样比对才准确。另外注意的是，Marker的电泳条件也要符合DNA电泳的操作标准: 如果选择λDNA/EcoR I的酶切marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免Hind Ⅲ或EcoR I酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

凝胶不平整：梳子不干净有污染，加样孔不平整也会影响图的效果；

电泳条件：电压不稳，电泳时间不超过1h。电压过高，会导致小片段跑出胶，出现条带缺失现象。

缓冲液：TBE的缓冲能力更强，如果缓冲液缓冲性能下降，会导致DNA电泳条带模糊，不规则迁移等。TAE建议换成TBE效果更好。另外建议配胶时的缓冲液和电泳缓冲液是同时配制。

染色剂：GelRed（312nm激发UV成像）无毒，性价比高，灵敏度比传统EB高10倍以上，注意观察凝胶时应根据染料不同，使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带出现模糊等情况。

GelRed/ GelGreen经过埃姆斯AMS和相关测试，已经被证明是替代EB和SYBR染料更为安全的产品。不过，请使用这些试剂时，也要遵循实验室安全条例等。

GelRed/ GelGreen是超敏感的染料。有些用户反馈可以检测含量＜0.1ng的DNA。然而，染色的灵敏度取决于仪器的性能和曝光设置等。

水溶解的产品与储存在DMSO中的产品比较，是一个全新的改良。由于DMSO会被皮肤吸收，我们建议染料溶于水，以避免处理二甲基亚砜存在的潜在危害。鉴于有些用户不希望改变实验方案，我们将继续提供储存在DMSO的染料。经过内部测试，两种溶剂方案的效果相似。

是的，但最好再添加一些染料，保证重新制备凝胶的信号强度。

GelRed和GelGreen染料是稳定的。在保证琼脂糖凝胶的完整性不会被破坏的前提下，你可以将预制的GelRed / GelGreen凝胶储存供以后使用。我们建议在4℃避光贮存凝胶。

GelRed和GelGreen可用于单链DNA和RNA的染色，但GelRed染单链核酸效果比GelGreen敏感5倍左右。使用荧光酶标仪的滴定实验表明，GelRed绑定单链DNA和RNA荧光信号约是结合双链DNA的一半左右。

CF最初是Cyanine-based Fluorescent dyes的缩写，这些是第一批基于花青素染料结构的专利CF染料。从那时起，我们的CF染料专利组合已经扩大到包括4种不同的核心结构荧光染料，涵盖了从紫外到近红外的荧光光谱

CF染料的化学结构现在还是机密，但是等到专利申请下来就会完全公开。一般来说，CF染料的结构可被分成2个部分：a）芳环骨架决定了染料的颜色或者吸收/发射波长；b）核心结构修饰元素。目前，CF染料拥有香豆素、芘、罗丹明或花青素染料的核心结构。蓝色荧光染料是基于香豆素或芘染料的核心结构，而绿色到近红外CF染料是基于青色素或者罗丹明核心结构。核心结构修饰元素涉及到核心结构上各种各样的化学附件，是CF染料发明的关键方面，使得VF染料优越于其他商业染料。

CF染料稳定性有3个方面：1）染料核心结构的化学稳定性；2）活性基团的稳定性；3）染料的耐光性。

CF染料涵盖香豆素、芘、罗丹明、花青染料的核心结构，所有的这些都具有卓越的化学稳定性。一般来说，染料都会比它所结合的抗体或者生物分子更加稳定。CF染料在用于PCR或者核算分子杂交等需要高温的情况下标记核酸也具有足够的稳定性。

活性CF染料用于生物偶联是包含活性基团。在这么多活性基团中，只有胺活性琥珀酸亚胺酯（SE）和硫醇活性马来酰亚胺基团对水解敏感，因此是水分敏感。CF染料的SE产品相对于其它商业SE染料更加稳定。这是因为CF SE染料源自于脂肪族羧酸组，从而比SE形式更加稳定。然而其他商业用SE染料通常源自于芳香羧酸组，比SE形式不稳定。

耐光性指的是染料抵抗光漂白的能力。是当染料经受一段时间强烈的光照，例如在使用共聚焦显微镜时，耐光性是一个主要考虑的问题。在核心结构的4种类型中，罗丹明是最不感光的，其次是青色素、芘、香豆素。结构修饰基团和其附属于染料核心的方式是CF染料技术重要的创新方面，使得染料比其他商业染料具有卓越的耐光性。一般来说，罗丹明为基础的CF染料，它的波长范围从绿色到近红外区域，具有最好的耐光性，是显微镜应用的最佳选择。

CF染料在PH至少2-11范围内是化学稳定的。大多数的CF染料对PH相对不敏感，除了CF405M, CF568, CF620R, 和 CF633，这些染料的荧光在PH低于4.5时变得微弱。

CF染料是高度水溶（>100mg/ml）的。在其他极性溶剂中也极易溶解，如DMSO,DMF,甲醇，乙醇。然而，CF染料在非极性溶剂中微溶，甚至不溶。

大多数CF染料带1-2负电荷，而少数青色素为基础的近红外CF染料带3-4负电荷。然而，带更多负电荷的染料拥有独特的结构特点，能够隐蔽负电荷，从而染料结合的像抗体这样的生物分子因为过多的负电荷而不会失去特异性。

答：标记的原理是化学性质的，也就是说染料是通过共价化学键的方式与抗体之间进行结合。化学共价键的结合方式能够确保在多重染色的情况下，多种被不同CF染料标记试剂盒标记的抗体之间不会发生染料重分布和迁移。

答：这个问题涉及到我们产品创新，染料独一无二的制备，加上缓冲体系以及标记的原理过程可非常完美的解决这个问题。使用Mix-n-Stain标记试剂盒，您绝不用担心这个问题。至于详细的机理过程正是我们独创的专利保护技术，恕不能公布。

答：在试剂盒推荐的样品量范围内，无需计算染料的用量和反应时间，只需直接把样品加入标记。只需要把你的抗体样品与CF染料在提供的小管里加上反应缓冲液进行混合标记，就可以得到非常理想的标记效果。传统的标记试剂盒在使用时就必须要计算好染料与蛋白抗体的反应配比，以确保不会过染或染色不充分。过染会导致荧光淬灭，丢失抗体的特异性结合位点等，以致会使能检测到的荧光信号大大减弱。这些问题在Mix-n-Stain标记试剂盒标记过程中，都不用担心，因为在染料的特性和反应缓冲体系已完美的解决了这些问题。

答：Mix-n-Stain主要是针对抗体而设计的，不推荐使用Mix-n-Stain标记其他非抗体的蛋白。

答：Mix-n-Stain试剂盒推荐的抗体浓度是0.5~1.0mg/ml。如果你的抗体初始浓度太低，你可以低速离心的方法进行离心处理或者冻干法处理进行浓缩。如果你的抗体浓度高于这个范围的话，你可以使用1X的PBS稀释。推荐浓度以外的抗体初始浓度将可能导致过染或者染色不饱和，会直接影响结果。

答：加样时间大约是30秒，也就是取决于你的操作。之后放置30分钟的时间进行染色反应，整个过程就完成了。你可以马上使用前面已经标记好的抗体进行下一步试验，比如显微观察，流式细胞术和WB分析等。如果要把标记好的抗体进行长期保存，我们推荐使用试剂盒自带的保存液进行保存，适当的保存条件至少可以保存6个月。

答：试剂盒反应缓冲体系可以兼容的缓冲体系有PBS、HEPES、MES、MOPS以及硼酸盐缓冲体系。缓冲体系中的含有20mM的Tris 也是可以兼容的，但当Tris浓度高于20mM的时候推荐使用前面提到的冻干法或者离心法进行清洁处理。

答：不能，强烈要求在标记反应前，使用清洁步骤去除这些不必要的介质。

答：如果使用Mix-n-Stain提供的保存液，于4℃或者更低的温度下可以至少保存3个月。如果要更长时间的保存，推荐温度为-20℃。跟其他的标记试剂盒比如Invitrogen的Zenon相比，CF-抗体偶合物是通过化学键的方式结合，而非物理方式结合，因此具有高度的稳定性。

当进入对数期的循环数大于35时，Real Time RT-PCR检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在 32-35 个循环时，需要有至少3 个重复才能判断是否能检测到基因的表达。

由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、光程差异，仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这些因素对定量结果的影响。这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实现，一般采用红色ROX荧光，称为阳性参比信号。最后，样品的实际荧光值除以ROX的实际荧光值，得出Rn值，这样光程差的影响就消除了。ROX校正可以提高定量数据的精度和重现性，减少孔间差异。

1）引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；

2）引物浓度不佳：适当调整引物浓度；

3）退火温度低：提高退火温度；

4）镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；

5）模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA 的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。

1）反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；

2）PCR各种反应成分的降解或加样量不够；

1）反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；

2）引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

3）探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；

4）模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；

5）模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。

1 The excitation and emission filters of the microplate reader are not optimal for AccuBlue nextGen. In fact, it is the emission filter which is not suited to this kit. The only information I can find about this plate reader model is that it is an absorbance plate reader so I am not able to check the bandwidth of the emission filter. If this is an absorbance reader, the AccuBlue kit will not work, and the fluorescence microplate reader needs to have an emission filter which detects green fluorescence such as a FITC filter set or 507 nm. I recommend finding a different emission filter around 507 nm, or a different kit. 

AccuBlue High Sensitivity emits at a longer wavelength but it is still not a good fit for the emission filter your customer has.

2 AccuBlue® NextGen limit of detection is in the range of 1 pg to 5 pg depending on instrument sensitivity

3 Please see the following table for the effect of buffer additives we have measured on the signal of AccuBlue® NextGen. FBS may contain some DNA and may affect the accuracy of the measurement.